Сложные реакции иммунодиагностики. Реакция связывания комплемента (РСК). Феномен лаковой крови. Этапы, техника реакции связывания комплемента.
(РСК ) предложена Ж. Борде и О. Жангу . Реакция включает две фазы (рис. 10-18).
Рис. 10-18. Реакция связывания комплемента . А - отрицательная реакция. Специфические в отношении исследуемого Аг AT отсутствуют. Образования иммунных комплексов, связывающих комплемент, не происходит. Молекулы комплемента сорбируются на клетках-мишенях (эритроцитах), вызывая их лизис. Б - положительная реакция. Имеющиеся в сыворотке AT специфически связывают исследуемый Аг, образуя иммунный комплекс. Последний связывает комплемент, и лизиса эритроцитов не наблюдают.В фазе I (специфической) реакции связывания комплемента (РСК) искомый Аг (или AT) реагирует с диагностической антисывороткой (или Аг-диагностикумом) и комплементом. Образующийся комплекс Аг-АТ связывает комплемент.
В фазе II (индикаторной) реакции связывания комплемента (РСК) определяют наличие свободного комплемента внесением в реакционную среду гемолитической системы - эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей AT к ним. Если Аг и AT не соответствуют друг другу и не образуют иммунных комплексов, то связывания комплемента не происходит. В этом. случае свободный комплемент взаимодействует с компонентами гемолитической системы, фиксируясь на комплексе эритроцит-антиэритроцита рное AT. Следствие этого - гемолиз индикаторных клеток (феномен «лаковой крови») - реакцию считают отрицательной.
Если в фазе I реакции связывания комплемента (РСК) AT и Аг соответствуют друг другу, то образующиеся иммунные комплексы связывают комплемент, разрушения эритроцитов после внесения гемолитической системы не наблюдают и реакцию считают положительной. Основные недостатки РСК: сложность (включает 5 компонентов), лабильность некоторых компонентов [их необходимо готовить прямо перед постановкой реакции (комплемент) либо за несколько суток (эритроциты барана)] и возможные антикомплементарные свойства у сывороток и Аг. Тем не менее РСК применяют в диагностике многих заболеваний, например при диагностике сифилиса (реакция Вассерманна).
РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для:
1) серологической диагностики инфекционных заболеваний (р. Вассермана – при сифилисе, р. Борде–Жангу – при хронической гонорее и др.);
2) идентификации бактерии и др. микробов.
РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ и АТ, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.
РСК проводится в два этапа при участии двух систем:
1) первая система – АГ+АТ+комплемент – обуславливает связывание комплемента в том случае если АТ соответствует АГ. В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным;
вторая система (индикаторная) – гемолитеческая сыворотка (гемолизины) + эритроциты – показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т. к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент (см. прилож. 3, рис.7 и 8).
Компоненты реакции:
1) испытуемая сыворотка (предварительно инактивируют нагреванием при 56 0 С в течение 30 минут);
2) антиген (изготавливается из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экстрактов тканевых липидов);
3) комплемент;
4) гемолитическая сыворотка;
5) 3% взвесь эритроцитов барана;
6) физиологический раствор;
7) контрольная сыворотка.
Комплемент . В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.
Титр комплемента – наибольшее разведение комплемента которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.
Рабочая доза комплемента – количество комплемента, которое выше тира на 25%.
Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50% взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 0 С. Определяют титр и рабочую дозу.
Титр сыворотки – максимальное разведение сыворотки которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.
РСК Борде –Жангу
Реакция ставится для диагностики хронической гонореи с целью обнаружения антител к гонококку.
В РСК участвует 2 системы: основная система – испытуемая сыворотка, антиген, комплемент и вспомогательная, индикаторная или гемолитическая система – гемолитическая сыворотка и эритроциты барана.
Если в первой системе образуются специфический комплекс антиген + антитело, то комплемент адсорбируется (соединяется с этим комплексом) и гемолиза во второй системе не происходит.
Для реакции требуется:
1. Испытуемая сыворотка, которая получается из крови, взятой пункцией локтевой вены больного. После свёртывания крови сыворотка отсасывается в отдельную пробирку и инактивируется 30 минут при 56 0 С на водяной бане.
2. Антиген - взвесь убитых гонококков.
3. Эритроциты барана получают из стерильно взятой дефибринированной крови. Их отмывают, центрифугируя 3 раза с новыми порциями физиологического раствора. В реакции используют 3 % взвесь эритроцитов.
4. Гемолитическая сыворотка готовится заранее путём иммунизации кроликов эритроцитами барана. Перед употреблением производится титрование сыворотки.
5. Комплемент - свежая сыворотка морской свинки. Из сердца морской свинки шприцем насасывается кровь, после свёртывания отделяется сыворотка. Перед опытом вытитровывается рабочая доза комплемента. Для этого берут основное разведение комплемента 1:10 и разливают его по пробиркам, от 0,1 до 0,5, после чего объем в каждой пробирке доводят физиологическим раствором до 1,5 мл.
Одновременно заготавливают гемолитическую систему - разведенная в тройном титре гемолитическая сыворотка + 3 % взвесь эритроцитов барана. Оба ингредиента в разных объемах и выдерживают в термостате 30 минут (сенсибилизация смеси), после чего смесь добавляют по 1 мл в пробирки помещают в термостат на 30 минут. Контролем служат 3 пробирки:
1. 1мл гемолитической системы + 1,5 мл физиологического раствора;
2. 0,5 мл комплемента 1:10 + 0,5 мл взвеси эритроцитов + 1,5 мл физиологического раствора.
Титром комплемента называется его минимальное количество, при котором ещё происходит гемолиз. Для постановления реакции берут рабочую дозу комплемента, увеличенную против титра на 20-25 % т. е., обычно то количество комплемента, которое имеется в предпоследней пробирке с гемолизом. Увеличение дозы комплемента необходимо потому, что в реакции активность комплемента может оказаться несколько подавленной другими ингредиентами реакции (антиген, сыворотка).
Постановка основного опыта РСК Борде - Жангу.
В начале в 2 пробирки разливается инактивированная и разведённая 1:5 испытуемая сыворотка. Затем в 1-ю пробирку приливается антиген, во вторую физиологический раствор. После этого во все пробирки добавляются рабочая доза комплемента.
После смешивания ингредиентов штатив с пробирками помещается в термостат при 37 0 С на 30 минут (горячее связывание). При холодном связывании штатив с пробирками помещается в ледник при температуре -4 0 С на 18 часов. После выдерживания в термостате во все пробирки добавляется гемолитическая система. Реакция ставится в объёме 0,5 мл. Пробирки снова помещают в термостат на 2 часа, после чего производится предварительная регистрация результатов. Пробирки остаются при комнатной температуре, а на следующий день отмечается окончательный результат.
Степень интенсивности реакции оценивается в плюсах. Полная задержка гемолиза - четыре плюса (++++), неполная - три, и один плюс. Полный гемолиз обозначается минусами (-).
РСК Вассермана
Ставится для диагностики сифилиса с целью обнаружения антител, а также для определения эффективности специфической терапии. Она основана на принципе реакции связывания комплемента Борде-Жангу. Существенным отличием реакции Вассермана является неспецифичность антигена: в качестве антигена употребляют липоидные экстраты из нормальных органов животных.
Для постановки реакции Вассермана необходимо иметь сыворотку больного, диагностикумы перекрестнореагирующие антигены № 1 и № 2, комплемент, гемолитическую сыворотку, эритроциты барана, физиологический раствор.
Диагностикум № 1 - специфический, трепонемный.
Диагностикум №2 - неспецифический, кардиолипиновый антиген, который представляют собой высокоочищенный экстракт бычьего сердца, имеющий постоянный химический состав липоидов. Липоиды, экстрагированные из сердца, по химическому составу близки к липоидам бледной трепонемы, поэтому хотя и не являются специфическими, но фиксируют антитела против спирохеты. Указанные антигены выпускаются централизованно и в реакцию употребляются, разведёнными согласно к титру, указанному на этикетке.
Одновременно с основным опытом ставят 2 контроля: с заведомо отрицательной и заведено положительной сыворотками.
Реакция связывания комплемента (РСК) – это метод серологического анализа, который по своей чувствительности сравним с методами преципитации, агглютинации и нейтрализации. РСК представляет собой метод, где используются две системы антиген-антитело:
первая – специфическая;
вторая – индикаторная (гемолитическая).
Для проведения РСК необходимы 5 компонентов: диагностируемый антиген, диагностические антитела, антиген-индикатор (эритроциты барана), индикаторные антитела (кроличьи гемолизины), комплемент.
Специфическое взаимодействие антигена и антитела сопровождается связыванием комплемента. Образовавшийся комплекс визуально не проявляется. В качестве индикатора используется гемолитическая система. Гемолитическая сыворотка сенсибилизирует эритроциты к действию комплемента, в присутствии которого происходит лизис эритроцитов (гемолез). Если гемолиза нет, значит комплемент связан первой системой, и, следовательно, антиген в ней соответствует антителу – положительный ответ. Если антитело не соответствует антигену, комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой, вызывая гемолиз – реакция отрицательная.
Для постановки РСК все ингредиенты реакции подготавливают и титруют до проведения основного опыта.
Сыворотку (больного или диагностическую) накануне проведения реакции прогревают на водяной бане при температуре 56ºС в течение 30 мин для инактивации ее собственного комплемента. Некоторые сыворотки, особенно иммунизированных животных, обладают антикомплементарными свойствами, т.е. способностью связывать комплемент в отсутствии гомологичного антигена. Антикомплементарность устраняют путем обработки их углекислым газом, прогреванием при температуре 57-58ºС, однократным замораживанием при температуре -20ºС или -70ºС и удалением осодка центрифугированием, добавлением к сыворотке комплемента в объеме 1:10 сыворотки и прогреванием ее после инкубации на холоде в течение 18-20 ч. Для предотвращения антикомплементарности сывороток их хранят в лиофилизированном виде или замороженном состоянии при низких температурах.
Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганиз мов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вируссодержащие материалы. Многие антигены из микроорганизмов получают производственным путем. Антикомплементарность антигенов устраняют при помощи таких методов, как термолиз (многократное замораживание и оттаивание), обработка жирорастворителями (эфиром, хлороформом, ацетоном), спиртами (метанолом, этанолом) и т.д.
В качестве комплемента используют сыворотку морской свинки, взятую непосредственно перед опытом; можно также применять сухой комплемент. Чтобы получить основной роаствор для последующего титрования, комплемент разводят 1:10 изотоноческим раствором натрия хлорида.
Эритроциты барана используют в виде 3 взвеси на изотоническом растворе натрия хлорида. Кровь (100-150 мл) берут из яремной вены, помещают в стерильную банку со стеклянными бусами, дефибринируют путем встряхивания в течение 10-15 мин и фильтруют через 3-4 слоя стерильной марли для удаления фибрина. Эритроциты отмывают 3 раза изотоническим раствором натрия хлорида, доливая его к осадку эритроцитов до первоначального объема крови. Эритроциты можно хранить 5-6 дней при температуре 4-6ºС. Срок хранения эритроцитов увеличивается при их консервировании с формалином.
Гемолитическую сыворотку для РСК получают следующим образом Иммунизируют кроликов путем введения им в вену уха 50% взвеси отмытых эритроцитов барана (по 1 мл 4-6 раз через день). Через 7 дней после последней инъекции получают пробную сыворотку. Если титр сыворотки не ниже 1:1200, то делают кровопускание. Сыворотку прогревают 30 мин при температуре 56ºС. Для предупреждения бактериального пророста в гемолитическую сыворотку добавляют консервант (мертиолят 1:10000 или 1 борную кислоту).
Гемолитическая система состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки (взятой в тройном титре) и 3 взвеси эритроцитов барана. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37ºС в течение 30 мин.
Титрование гемолитической сыворотки. Сыворотку титруют путем соединения 0,5 мл ее (в разведениях 1:600, 1:1200, 1:1600, 1:3200 и т.д.) с 0,5 мл 3 взвеси эритроцитов и 0,5 мл свежего комплемента в разведении 1:10. Объем смеси для реакции в контрольных пробирках доводят до 1,5 мл, добавляя изотонический раствор натрия хлорида. Результаты реакции учитывают через 1 ч инкубации при температуре 37ºС. Титром гемолитической сыворотки считают ее наибольшее разведение, вызывающее полный гемолиз. Хранят сыворотку в лиофилизированном виде.
Схема титрования гемолитической сыворотки
Ингредиент |
Номер пробирки |
|||
Контроль комплемента |
контроль гемолитической сыворотки |
Контроль эритроцитов |
||
Гемолитическая сыворотка в разведениях 1:600, 1:1200, 1:1600 и т.д. | ||||
Взвесь эритроцитов барана | ||||
Комплемент в разведении 1:10 | ||||
Титрование комплемента. Перед проведением опыта основной раствор комплемента (1:10) разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл и добавляют в каждую изотонический раствор натрия хлорида, доводя объем жидкости до 1,5 мл. Пробирки помещают в термостат при температуре 37ºС на 45 мин, затем добавляют в них гемолитическую систему и выдерживают в термостате в течение 30 мин, после чего определяют титр комплемента.
Для опыта берут рабочую дозу комплемента (содержащуюся в объеме 0,5 мл), которая выше титра на 20-30%.
Схема титрования комплемента
Ингредиент, мл |
Номер пробирки |
|||||||||||
Контроль |
||||||||||||
Комплемент в разведении 1:10 | ||||||||||||
Изотонический раствор натрия хлорида |
Термостат при температуре 37ºС в течение 45 мин
Термостат при температуре 37ºС в течение 30 мин
Титрование антигена. Антигены, используемые для РСК могут адсорбировать какое-то количество комплемента, т.е. обладать антикомплементарными свойствами. Поэтому перед проведением опыта антигены титруют в присутствии рабочей дозы комплемента. В меньшей степени антикомплементарные свойства выражены у специфических антигенов, выпускаемых производственным путем. Их титр определяют не перед каждым опытом, а один раз в месяц, учитывая возможность его уменьшения в процессе хранения.
Для определения титра антигена его разливают в ряд пробирок в уменьшающемся количестве от 0,5 до 0,05 мл, доводя объем в них до 1 мл путем добавления раствора натрия хлорида. Затем в каждую пробирку добавляют 0,5 мл рабочей дозы комплемента и помещают их в термостат на 1 ч при температуре 37ºС. После этого во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, снова выдерживают их в течение 1 ч в термостате и учитывают результаты реакции.
Титром антигена считают наименьшее его количество, при котором наступает полный гемолиз. Для РСК используют рабочую дозу антигена, составляющую примерно 1/2-1/3 титра. Антигены, в присутствии которых титр комплемента уменьшается более чем на 30%, непригодны для реакции.
Схема титрования антигена
Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч
Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч
Проведение основного опыта РСК. Общий объем ингредиентов реакции – 2,5 мл, объем рабочей дозы каждого из них – 0,5 мл. В первую пробирку вносят сыворотку в соответствующем разведении, антиген и комплемент, во вторую – сыворотку в соответствующем разведении, комплемент и изотонический раствор натрия хлорида (контроль сыворотки), в третью – антиген, комплемент и изотонический раствор натрия хлорида (контроль антигена). Одновременно готовят гемолитическую систему, смешивая по 2 мл гемолитической сыворотки в тройном титре (по отношению к указанному в инструкции) и 3% взвеси эритроцитов барана (по отношению к исходному объему крови). Пробирки выдерживают в термостате при температуре 37ºС в течение 1 ч, затем в первые 3 пробирки (первая система) добавляют по 1 мл гемолитической системы (вторая система). После тщательного смешивания ингредиентов пробирки вновь помещают в термостат на 1 ч при температуре 37ºС.
Схема проведения основного опыта РСК
Номер системы |
Ингредиент, мл |
Номер пробирки |
||
Контроль сыворотки |
Контроль антигена |
|||
Исследуемая сыворотка в разведениях 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 и т.д. | ||||
Антиген (рабочая доза) | ||||
Комплемент (рабочая доза) | ||||
Изотонический раствор натрия хлорида |
Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч
Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч
Результаты реакции учитывают предварительно – после извлечения пробирок из термостата и окончательно – после пребывания их в течение 15-18 ч в холодильнике или при комнатной температуре.
При окончательном учете интенсивность реакции выражают плюсами: (++++) – резко положительная реакция, характеризующаяся полной задержкой гемолиза (жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты оседают на дно); (+++, ++) – положительная реакция, проявляющаяся усилением окраски жидкости вследствие гемолиза и уменьшением количества эритроцитов в осадке; (+) – слабо положительная реакция (жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов). При отрицательной реакции (–) наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно розовую окраску (лаковая кровь).
Предложен ряд модификаций РСК, отличающихся повышенной чувствительностью и меньшим объемом используемых ингредиентов. Так, например, при вирусологических исследованиях объем ингредиентов для РСК на холоде – 1 мл. Для капельной РСК берут 1 каплю сыворотки + 1 каплю антигена + 1 каплю комплемента + 2 капли гемолитической системы.
Реакция связывания комплимента нашла самое широкое распространение в микробиологической и серологической диагностике.
С помощью РСК обнаруживают комплементсвязывающие антитела в сыворотке крови больных сифилисом, сапом, хронической гонореей, риккетсиозами, вирусными заболеваниями и др.
Особый интерес РСК представляет для клинической иммунологии. Реакцию применяют для выделения различных субпопуляций лимфоцитов, для выявления антигенов HLA на тромбоцитах, перевиваемых лимфобластах, фибробластах, опухолевых клетках и тромбоцитоспецифических антигенов, а также соответствующих антител.
В основе реакции лежат два явления - бактериолизис и гемолиз. В их проявлении участвует комплемент. Поэтому в РСК применяют две системы компонентов: 1) обеспечивает феномен бактериолизиса и используется для диагностических целей; 2) гемолитическая, индикаторная, вспомогательная; позволяет установить, связался или не связался комплемент в первой системе (см. схему цв. рис. I). Ранее в качестве антигена использовали взвесь бактерий, поэтому первая система была названа бактериолитической (в положительных случаях происходил лизис бактерий).
Постановку РСК осуществляют в два этапа. На первом этапе готовят бактериолитическую систему: в пробирках смешивают по 0,5 мл исследуемой сыворотки с антигеном, добавляют комплемент в строго определенной дозе (титре). Смесь антиген - сыворотка-комплемент (бактериолитическая система) выдерживают в водяной бане (или термостате) 20...40 мин при 37...38 "С. Результат взаимодействия компонентов в пробирке невидим, жидкость остается прозрачной и бесцветной. Чтобы определить, связался ли комплемент в бактериолитической системе, осуществляют второй этап реакции: в пробирки добавляют компоненты гемолитической системы - отмытые эритроциты барана и инактивированную гемолитическую сыворотку, как показано в схеме. Все компоненты бактериолитической системы встряхивают для перемешивания в пробирке, помещают в водяную баню при 37...38 "С на 20...40 мин. Затем добавляют компоненты гемологической системы, вторично все встряхивают и вновь помещают в водяную баню на 10...15 мин.
Предварительный учет результата. Если сыворотка получена от больного животного, то в ней содержатся антитела, которые соединяются со специфическим антигеном. С этим комплексом (антиген - антитело) связывается комплемент - гемолиз не происходит, результат положительный.
В сыворотке от здорового животного антитела отсутствуют: комплекс антиген - антитело не образуется, комплемент в бактериологической системе не связывается. При добавлении эритроцитов и гемолизина (это между собой антиген и антитело) комплемент реагирует с этим комплексом - произойдет гемолиз, результат отрицательный (см. цв. рис. II).
Окончательный учет результата. Пробирки оставляют при комнатной температуре на 15...20 ч. Если в бакте-риолитической системе сыворотка была от больного животного, в пробирке образуется специфический комплекс антиген - антитело, который адсорбирует (связывает) весь добавленный комплемент. Следовательно, во второй, гемолитической, системе гемолиза не произойдет, эритроциты осядут на дно пробирки, надоса-дочная жидкость прозрачная. Результат РСК положительный.
Если в исследуемой сыворотке нет специфических антител к используемому антигену (в случаях, когда сыворотка от здорового животного), в бактериолитической системе комплекс антиген - антитело не образуется и, следовательно, комплемент в данной системе не адсорбируется, а остается свободным. При добавлении компонентов гемолитической системы (во второй фазе реакции) комплемент вступает во взаимодействие со вторым комплексом (гемолизин -эритроциты), происходит гемолиз эритроцитов - осадок не образуется, жидкость в пробирке лаково-красного цвета. Результат РСК отрицательный.
РСК. используют: 1) для обнаружения в сыворотке больного животного специфических антител (при диагностике бруцеллеза, перипневмонии, сапа, лептоспироза, трипанозомоза и др.); 2) для выявления в исследуемом материале специфического антигена (бактериального или вирусного) при наличии специфической иммунной сыворотки.
Для постановки РСК необходимо иметь: пробы сывороток, поступившие для исследования; две сыворотки, заведомо позитивные (стандартные, обеспечивающие положительный результат), и две нормальные сыворотки. Все сыворотки в разведении 1: 10 инактивируют при 56...58 °С 30 мин; антиген в разведении согласно титру; комплемент, разведенный в соответствии с установленным титром при титровании в бактериолитической системе; гемолизин в рабочем титре; эритроциты барана (I: 40); физиологический раствор, градуированные пипетки, пробирки, штативы, водяную баню на 37...38 °С.
Перед постановкой РСК кровь барана дефибринируют, эритроциты отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования до полной прозрачности надосадочной жидкости, которую удаляют отсасыванием, а осажденные эритроциты разводят в физиологическом растворе 1:40 (2,5 %). Антиген разводят согласно титру, указанному на этикетке биофабрикой. Гемолизин и комплемент перед постановкой РСК титруют.
Антиген для РСК готовят на биофабриках. Обычно это экстракты разрушенных микробных взвесей {или вируссодержа-гдей ткани). Антигены не должны обладать гемолизирующим действием, что контролируется в процессе постановки реакции (в пробирку наливают 1...2 дозы антигена и 0,5 мл взвеси эритроцитов: гемолиза не должно быть). На ампуле с антигеном биофабрика указывает, что он предназначен для РСК (сапной, бруцеллезный или другой). На упаковочной коробке указаны номер серии, дата изготовления, срок годности, активность антигена, то есть в каком разведении его надлежит использовать при постановке РСК (1:100, 1:150 и др.). При некоторых заболеваниях антигеном служат другие материалы; например, для диагностики перипневмо-нии крупного рогатого скота антигеном для РСК служит лимфа теленка, экспериментально зараженного подкожно или интра-плеврально. При длительном хранении антигенов их титр вновь проверяют в лаборатории по специальной схеме титрования.
Испытуемые сыворотки, поступившие для исследования, разводят физиологическим раствором 1: 5 или 1: 10, инактивируют прогреванием в водяной бане для разрушения собственного комплемента 30 мин при 56...58 "С (сыворотки ослов, мулов, лошаков - при 61 °С).
Гемолизин готовят на биофабриках путем гипериммунизации кроликов отмытыми эритроцитами барана. Для этого кроликам внутривенно вводят 4...5 раз с 2...3-дневными интервалами 40...50%-ю взвесь эритроцитов. Через неделю после последней инъекции у кроликов берут кровь, стерильно отсасывают сыворотку, инактивируют ее, консервируют глицерином 1:1 или 0,5%-м фенолом, титруют, разливают по ампулам. В лабораториях перед постановкой РСК вновь титруют.
Схема титрования гемолизина. Необходимо подготовить: i) разведение комплемента 1: 20; 2) гемолизин 1:100 (0,2 мл гемолизина+9,8 мл физраствора); 3) взвесь эритроцитов барана 1:40; 4) физиологический раствор NaCl.
Для постановки реакции титрования в штативе размещают два ряда пробирок - один вспомогательный только для приготовления разведений гемолизина, второй - собственно для титрования. В первую пробирку каждого ряда вносят исходное разведение гемолизина 1: 100, а затем производят последовательное разведение. Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37...38°С на 10...15 мин. Учет результата: в данном примере наименьшее количество (или его наибольшее разведение), давшее полный гемолиз, составляет 1: 2000, т. е. это его фактический титр. Рабочий титр в 2 раза концентрированнее - 1:1000.
По 0,5 мл (указано стрелками) каждого разведения из пробирок первого ряда переносят в отдельные пробирки второго ряда. Во все пробирки второго ряда добавляют по 0,5 мл комплемента (1: 20), по 0,5 мл эритроцитов барана (2,5%-я взвесь, или 1: 40) и по 1 мл физраствора, чтобы объем жидкости в каждой пробирке составлял 2,5 мл.
Примечание. Исходя из того что в окончательной постановке РСК будут участвовать 5 компонентов по 0,5 мл, которые составят объем 2,5 мл, на протяжении всей работы этот объем соблюдается.
Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню на 10...15 мин. Гемолиз прежде всего произойдет в пробирках с большим содержанием гемолизина (наименьшим его разведением - 1: 500, 1:1000...). Наименьшее количество гемолизина (наибольшее его разведение), вызвавшее полный гемолиз эритроцитов в данных условиях, называется предельным (фактическим) титром гемолизина. Для дальнейшей работы гемолизин используют в 2 раза концентрированнее, то есть в удвоенном количестве, удвоенном титре, который называют рабочим титром. Например, если фактический титр I: 2500 (или 1: 2000), то рабочий титр соответствует разведению 1:1250 (или 1: Ш00).
К о м п л е м е н т -это составная часть свежей сыворотки, лимфы, тканевых жидкостей разных видов животных (и человека); открыт Бухнером (1889). У насекомых комплемент отсутствует. Комплемент - вещество белковой природы, сложной структуры, быстро инактивируется при нагревании, длительном хранении, воздействии ультрафиолетового излучения, сильном встряхивании, фильтрации через керамические фильтры, добавлении каолина, кислот, щелочей, алкоголя, ацетона, хлороформа, дистиллированной воды, взвеси бактерий и др. Комплемент можно консервировать добавлением на 100 мл сыворотки морской свинки 5 г сульфата натрия, 4 г борной кислоты. Активность комплемента при этом сохраняется до полугода. Лучший способ консервирования - высушивание в условиях вакуума при низкой температуре (лиофилизация). В запаянных ампулах в таком состоянии он сохраняется два года. Перед каждой постановкой РСК активность комплемента проверяют титрованием, то есть определяют его титр - оптимальное количество, необходимое для данной реакции. Комплемент титруют дважды: в гемолитической и бактери-олитической системах.
Для титрования комплемента в гемолитической системе готовят компоненты: комплемент в разведении 1: 20 (1 мл комплемента + 19 мл физраствора); гемолизин, разведенный соответственно рабочему титру; взвесь отмытых эритроцитов барана (1: 40), физиологический раствор. В штатив ставят пробирки и разливают в них градуированной пипеткой разное количество комплемента с интервалом 0,03 мл (0,13; 0,16; 0,19; 0,22..: до 0,43 мл). Затем добавляют остальные компоненты (рис. 57). Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37...38 "С на 10...15 мин и проводят учет результата.
Учет результата: наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный гемолиз (в данном примере - 0,25 мл), принимают за титр комплемента.
Результат титрования начинают учитывать в пробирках с наибольшим содержанием комплемента, где прежде всего ожидается гемолиз. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный гемолиз эритроцитов при данных условиях, называют титром комплемента в гемолитической системе.
Для титрования комплемента в бактериолитической системе необходимо иметь все компоненты реакции: комплемент (1:20), эритроциты (1: 40), гемолизин в рабочем титре, две позитивные и две нормальные сыворотки, специфический антиген. Сыворотки разводят физраствором 1: 10, инактивируют 30 мин при 56...58 X. Каждую сыворотку разливают в два ряда пробирок по 0,5 мл. В пробирки каждого ряда добавляют комплемент в возрастающих количествах, как при титровании в гемолитической системе; начинают с количества, принятого за титр в гемолитической системе, затем в каждой последующей пробирке дозу увеличивают на 0,03 мл, выравнивая объем до 0,5 мл физиологическим раствором.
После этого в один ряд пробирок с позитивной и нормальной сыворотками добавляют по 0,5 мл антигена, во второй ряд каждой сыворотки-по 0,5 мл физиологического раствора. Все пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 30...40мин. Затем во все пробирки вносят по 0,5 мл гемолизина и по 0,5 мл эритроцитов, встряхивают и вторично помещают в водяную баню на 10...15 мин. Наименьшее количество комплемента, обеспечившее полный лизис эритроцитов в обоих рядах пробирок (с антигеном и без антигена) двух нормальных сывороток, в одном ряду (без антигена) каждой позитивной сыворотки и с полной задержкой (отсутствием) гемолиза в рядах позитивных сывороток с антигеном (в тех же дозах комплемента), называют титром комплемента, который используют в постановке главного опыта РСК при диагностических исследованиях.
Главный опыт РСК (собственно диагностическое исследование). В штативы ставят два ряда пробирок по количеству исследуемых проб сывороток. По 0,5 мл каждой инактивирован-ной сыворотки наливают в две пробирки: в одну добавляют антиген - 0,5 мл, в другую (без антигена) 0,5 мл физраствора и, добавив комплемент, составляют бактернолитическую систему, а затем добавляют гемолитическую.
Необходимые компоненты: 1) исследуемая сыворотка, инактивированная, разведенная физиологическим раствором 1: 10; 2) специфический антиген, разведенный согласно титру, указанному биофабрикой на этикетке упаковки; 3) комплемент в установленном титре; 4) гемолизин в рабочем титре; 5) взвесь отмытых эритроцитов барана 1: 40; 6) физиологический раствор NaCI. Исследуемые сыворотки разливают в два ряда пробирок. Для любого количества исследуемых сывороток в качестве контроля используют заведомо позитивную сыворотку (дающую положительный результат) и нормальную (от здорового животного, дающую отрицательный результат).
Пробирки с компонентами бактериолитической системы встряхивают, помещают в водяную баню на 20...40 мин при 37...38°С. Пробирки бактериолитической системы второго ряда без антигена встряхивают, помещают в водяную баню при тех же условиях.
Затем во все пробирки первого и второго ряда добавляют компоненты гемолитической системы, вторично помещают в водяную баню на 10..15 мин. Во всех пробирках второго ряда без антигена наступает полный гемолиз.
До получения окончательного результата пробирки оставляют при комнатной температуре на 18...24 ч. Во всех пробирках без антигена, независимо, от больного или от здорового животного получена сыворотка, должен наступить гемолиз, в пробирках первого ряда с антигеном более четкий результат выражен при отстаивании.
Показания реакции в пробирках с испытуемыми сыворотками считают достоверными, если в пробирках с позитивными сыворотками и антигеном гемолиз отсутствует при полном гемолизе в пробирках с позитивной сывороткой без антигена и во всех пробирках с заведомо нормальной сывороткой (рис. 61).
Данная реакция должна сопровождаться контролями антигена, комплемента, гемолизина, эритроцитов. Для этого в отдельные пробирки наливают антиген с эритроцитами барана; комплемент с эритроцитами без гемолизина; гемолизин с эритроцитами без комплемента; эритроциты и физиологический раствор. Объем в каждой пробирке доводят физраствором до 2,5 мл. Пробирки встряхивают, помещают в водяную баню при 37 °С на 20 мин. Во всех контрольных пробирках гемолиз должен отсутствовать.
Результат РСК принято выражать в «крестах». Показатели положительного результата реакции: + + + + (///) - полное осаждение эритроцитов (нет гемолиза), жидкость над осадком бесцветная, + + + (///) - жидкость над осадком едва заметно окрашена в желтоватый цвет. Сомнительный результат реакции: наличие осевших на дне эритроцитов и частичное окрашивание надосадоч-ной жидкости за счет лизиса некоторой части эритроцитов обозначают + + - (++), то есть два и два с половиной креста. Резко выраженный гемолиз (без осадка) или с небольшим осадком (+) - отрицательный результат.
Реакция длительного связывания комплемента (РДСК). Более эффективная по чувствительности в отличие от обычной классической РСК. Суть реакции заключается в том, что бактериолити-ческую систему выдерживают при трех различных температурных режимах: после смешения компонентов при комнатной температуре 15 мин, затем при низкой температуре (4 °С) в рефрижераторе 18...20 ч и в водяной бане 15 мин. После этого добавляют гемолитическую систему, встряхивают, вновь помешают в водяную баню и производят учет реакции, как при РСК. Подтверждена эффективность РДСК при диагностике ряда инфекционных болезней (туберкулез, вибриоз, бруцеллез идр,).
Реакция подавления связывания комплемента (РПСК), или реакция торможения, непрямая РСК. В данной реакции участвует еще один компонент - стандартная иммунная сыворотка, содержащая антитела к антигену, используемому обычно для диагностики и, следовательно, положительно реагирующая в классической РСК.
Исследуемую сыворотку смешивают с антигеном и некоторое время выдерживают без комплемента. Затем добавляют комплемент и стандартную сыворотку, пробирки встряхивают и помещают в водяную баню на 20...30 мин, после чего добавляют гемолитическую систему и вновь ставят в водяную баню. Если нет гемолиза-результат отрицательный, потому что испытуемая сыворотка не реагировала с антигеном и последний вступил в реакцию со стандартной сывороткой, связав комплемент. Если исследуемая сыворотка от больного животного, она содержит специфические антитела по отношению к антигену, т. е. происходит реакция между антигеном и антителами, не связывая комплемент. Антиген, взаимодействуя с антителами исследуемой сыворотки, не вступает в реакцию (подавляется) со стандартной (заведомо известной специфической) сывороткой, комплемент остается свободным и вступает в реакцию в гемолитической системе - происходит гемолиз, результат реакции положительный по отношению к исследуемой сыворотке.
Метод флуоресцирующих антител (МФА). Возможности данного метода обусловлены специфичностью первой фазы серологических реакций с высокой чувствительностью люминесцентного анализа. Для осуществления МФА необходимо иметь высокоспецифические иммунные люминесцирующие сыворотки. Известно, что в различных серологических реакциях, используемых в микробиологической практике, участвуют преимущественно три компонента: бактерийный антиген, антитело и комплемент. Все три компонента, по сути, являются антигенами, и против каждого из них могут быть получены иммунные сыворотки и, соответственно, люминесцирующие антитела. В зависимости от того, какого типа люминесцируюшую сыворотку используют (против бактерийного антигена, антибактериальных антител, комплемента), различают три основных варианта метода флуоресцирующих антител: прямой (1) и непрямой (2) варианты и модификация непрямого варианта с использованием комплемента. Иммунологическая реакция между антигеном и антителом осуществляется в этих модификациях непосредственно на предметном стекле. Для фиксации микроорганизмов применяют органические растворители: ацетон, этанол, метанол, диоксан, а также обычные фиксаторы, используемые в микробиологической практике: формалин, смесь Никифорова, жидкость Карнуа и др.
Прямой вариант. На готовый препарат наносят специфическую люминесцирующую сыворотку на определенное время, затем излишек сыворотки сливают, препарат промывают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Этот метод применяют для обнаружения бактерий в патологическом материале, объектах внешней среды, а также для идентификации возбудителей заболеваний в культурах.
Непрямой (двухступенчатый) вариант. На первом этапе происходит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом немеченой сыворотки. На втором этапе специфическое немеченое антитело связывается с антивидо-вым люминесцирующим антителом, содержащимся в сыворотке животного, иммунизированного глобулинами (или цельной сывороткой крови) того вида животных, от которых была использована иммунная сыворотка.
Непрямой антикомплементарный (трехступенчатый) вариант. Первый этап: образование комплекса антиген - немеченое антитело. Второй этап: наслаивание нормальной сыворотки, содержащей комплемент. Третий этап: комплекс антиген - антитело - комплемент обрабатывают люми-несцируюшей антикомплементарной сывороткой, приготовленной при иммунизации кроликов сывороткой того вида животного, которое служило источником комплемента.
Непрямые варианты МФА можно использовать как для выявления антигенов, так и для определения антител. Кроме того, для постановки двухступенчатого варианта нужно иметь ограниченный набор антивидовых люминесцирующих сывороток (против глобулинов быка, барана, лошади, свиньи и др.), а для антикомплементарного варианта достаточно иметь всего одну люминесцирующую сыворотку против глобулинов морской свинки.
Методика и м м у н о л ю м и н е с u e н т н о и микроскопии. В практике ветеринарных бактериологических лабораторий используют люминесцирующие сыворотки биофабричного производства. В зависимости от типа флуорохрома люминесцирующие сыворотки обеспечивают либо зеленое свечение объекта (краситель на основе флуоресценна), либо красное (краситель на основе родамина).
Для проведения иммунолюминесцентной микроскопии следует на обезжиренное тонкое без царапин предметное стекло нанести исследуемый материал. При исследовании органов и тканей животных готовят препараты-отпечатки тонким слоем. Препараты подсушивают на воздухе и помещают в фиксирующую жидкость (этанол - 15 мин, метанол - 5 мин, ацетон - 5 мин). Если необходимо, после фиксации препараты некоторое время можно сохранять в холодильнике. Последовательность и дальнейшие процедуры зависят от применяемого варианта МФА (одноступенчатый, двухступенчатый, трехступенчатый). Обработку препаратов люминесцирующими сыворотками, а также немечеными сыворотками первой ступени и комплементом проводят при 37 X в условиях влажной камеры {чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой) .
Одноступенчатый вариант. На предметное стекло с фиксированным исследуемым материалом наносят люминесцирующую сыворотку (в разведении, указанном на ампуле). Препарат помещают во влажную камеру на 15...20 мин при 37 "С. Затем его промывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,4) в сосуде, меняя раствор через 5...10 мин несколько раз, или под струей водопроводной воды в течение 3...5 мин. Вода должна быть нейтральной и не содержать железа. Затем препарат (на одном стекле может быть несколько мазков) подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой, после чего наносят каплю забуференного глицерина с рН 8,0 и покрывают покровным стеклом. На покровное стекло наносят иммерсионную нефлуоресцирующую жидкость и микроскопируют.
Двухступенчатый вариант. На предметное стекло с исследуемым материалом наносят каплю иммунной немеченой сыворотки первой ступени. Препарат помещают в термостат в условиях влажной камеры на 15...20 мин. Затем его промывают, как описано выше, подсушивают и наносят каплю люминесцирующей антиви-довой сыворотки. Препарат снова помещают в термостат в условиях влажной камеры на 15...20 мин. Повторяют процедуру промывания и высушивают фильтровальной бумагой. Наносят забу-ференный глицерин, покрывают покровным стеклом, наносят нефлуоресцирующую иммерсионную жидкость и микроскопируют.
Трехступенчатый вариант (антикомплементарный). На предметное стекло с исследуемым материалом наносят каплю иммунной немеченой сыворотки первой ступени. Препарат помещают в термостат, как описано выше, подсушивают и на мазок наносят каплю комплемента. Препарат вновь помещают во влажную камеру и в термостат на 15...20 мин, после чего промывают и наносят люминесцирующую антикомплементарную сыворотку. Последующие процедуры аналогичны одноступенчатому варианту.
Приготовление и обработка контрольных препаратов. 1. Для прямого варианта с целью определения специфичности реакции между антигеном с люминесцирующей сывороткой следует этой же сывороткой обработать препараты-мазки из гетерологичных видов микробов. Эти виды должны быть близкие в антигенном отношении, но отличающиеся по морфологии от исследуемых микроорганизмов; далекие в антигенном отношении к исследуемым микроорганизмам, но сходные по морфологии и распространению с ними. Препараты-отпечатки обрабатывают люминесцирующей нормальной сывороткой.
2. Для непрямого варианта необходимо иметь три контрольных препарата, обработанных нормальной сывороткой, люминесцирующей антивидовой сывороткой без иммунной немеченой сыворотки и люминесцирующей антивидовой сывороткой с заведомо иммунной сывороткой первой ступени.
3. Для непрямого варианта с комплементом необходимы контрольные препараты, при обработке которых иммунная сыворотка заменена нормальной сывороткой того же вида и в тех же разведениях, а также препараты, обработанные всеми ингредиентами, кроме иммунной сыворотки.
Оценка результатов. Учитывают яркость, цвет, локализацию и структуру свечения. Бактерии, окрашенные люминесцирующей сывороткой, меченной изотиоцианатом флуоресце-ина, имеют яркое зеленое свечение по периферии в виде ободка или ореола, центральная часть светится слабо. Такое свечение называется специфическим в отличие от неспецифического, когда все тело клетки светится равномерно. Чем более выпукло лежит бактерийная клетка в препарате, тем резче ободок. Объяснить такое свечение можно тем, что с единицы площади «периферии» клетки на сетчатку глаза наблюдателя проецируется в несколько раз больше антител, чем с центральной части клетки микроба. Следует иметь в виду, что у пластичных клеток (лептоспиры, вибрионы) нет контура или он заметен слабо. У клеток, погруженных в тканевую жидкость, и у молодых бацилл сибирской язвы контур обычно выражен нерезко.
Интенсивность свечения оценивают по четырехкрестовой системе: + + + + - очень яркая флуоресценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки; + + + - яркая флуоресценция периферии клетки; + + - слабое свечение периферии клетки; + - нет контрастного свечения периферии тела микробной клетки. Отсутствие специфического свечения обозначают «-» (видны тени микроорганизмов). При диагностике различных возбудителей положительным результатом чаще всего считают специфическое свечение бактерийных клеток не ниже чем на четыре или на три креста.
61. Реакции с участием комплемента. Реакция связывания комплемента. Механизм, компоненты, способы постановки, применение. Реакция радиального гемолиза
Реакции с участием комплемента
Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента комплексом антиген-антитело (реакция связывания комплемента, радиального гемолиза и др.).
Реакция связывания комплемента (РСК ) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc -фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент остается свободным (рис. 13.8). РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - ан- тиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.
РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана).
Эту реакцию применяют для обнаружения антител в сыворотке крови больных при бактериальных, вирусных, протозойных инфекциях, а также для определения и типирования вирусов, выделенных у больных. РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых, кроме антигена, антитела и комплемента, участвует еще и гемолитическая система, выявляющая результаты реакции. РСК протекает в две фазы: первая - взаимодействие антигена с антителом при участии комплемента и вторая - выявление степени связывания комплемента при помощи гемолитической системы. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, полученной путем иммунизации лабораторных животных, эритроцитами. Эритроциты обрабатывают - сенсибилизируют, присоединяя к ним сыворотку при температуре 37°С, в течение 30 мин. Лизис сенсибилизированных эритроцитов барана наступает только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. В отсутствие его эритроциты не изменяются. Результаты РСК зависят от наличия в исследуемой сыворотке антител. Если сыворотка содержит антитела, гомологичные антигену, используемому в реакции, то образующийся комплекс антиген - антитело присоединяет, связывает комплемент. При добавлении гемолитической системы в этом случае гемолиза не произойдет, так как весь комплемент расходуется на специфическую связь комплекса антиген - антитело. Эритроциты остаются не измененными, поэтому отсутствие гемолиза в пробирке регистрируют как положительную РСК. При отсутствии в сыворотке антител, соответствующих антигену, специфический комплекс антиген - антитело не образуется и комплемент остается свободным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и вызывает гемодиз эритроцитов. Разрушение эритроцитов, их гемолиз характеризует отрицательную реакцию.
Для постановки РСК необходимы: сыворотка больного,
комплемент, гемолитическая система, состоящая из эритроцитов барана и
гемолитической сыворотки, а также изотонический раствор хлорида натрия. Реакцию
ставят в серологических пробирках. Эритроциты барана получают из
дефибринированной крови барана путем троекратного отмывания их изотоническим
раствором хлорида натрия. Гемолитическую сыворотку выпускают в готовом виде в
ампулах, на этикетке которых указан ее титр, т. е. максимальное разведение
сыворотки, которое еще вызывает гемолиз при добавлении к эритроцитам в
присутствии комплемента. Гемолитическую сыворотку получают путем иммунизации
животных, например кролика эритроцитами барана. При постановке реакции
сыворотку используют в тройном титре. Например, титр гемолитической сыворотки 1: 1200, а рабочее разведение 1: 400. В качестве комплемента используют свежую
сыворотку крови морской свинки (в течение 24-48 ч) или сухой комплемент в
ампулах. Предварительно перед постановкой РСК комплемент разводят 1: 10 и
титруют для установления титра - наименьшего количества комплемента, которое
дает гемолиз эритроцитов при соединении с гемолитической системой, используемой
в данной реакции. Учитывая возможные антикомплементарные свойства антигена, при
постановке реакции к установленному рабочему титру комплемента делают 20-30%
надбавку.
Антигеном для РСК являются взвеси убитых бактерий, экстракты, приготовленные из
этих взвесей, отдельные химические фракции микробов. Основное требование к
антигену - отсутствие угнетения активности комплемента. Он не должен обладать
антикомплементарными свойствами. Для выявления этих свойств антигена комплемент
дополнительно титруют в присутствии используемого в реакции антигена.
Существуют определенные схемы постановки РСК. Результаты реакции учитывают по
наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов в гемолитической системе. РСК
применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция
Борде-Жангу), токсоплазмоза, риккетсиозных и вирусных заболеваний.
Реакцию радиального гемолиза (РРГ ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии антител) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после чего к этому комплексу присоединяются компоненты комплемента, вызывая гемолиз.