Кампилобактерии - Hem Ltd. Campylobacter spp:Селективный обогатительный бульон Болтона Принцип действия и свойства среды

Bolton Enrichment Broth Base

Назначение

Жидкая культуральная среда, используемая для выделения Campylobacter из пищевых образцов, согласно стандартам ISO 10272-1:2006.

Описание

Основа бульона Bolton - обогатительный бульон для Campylobacter из проб пищевых продуктов. При обработке и хранении продуктов питания клетки Campylobacter повреждаются, их размножение и рост могут быть простимулированы двойной инкубацией в бульоне Болтона.

Мясная пептонная вода и гидролизат лактальбумина являются источниками необходимых для роста углерода и азота. Хлористый натрий обеспечивает осмотический баланс, а карбонат натрия нейтрализует кислоту, образующуюся при росте микроорганизмов. Дрожжевой экстракт и кетоглутаровая кислота действуют как факторы роста. Включение метабисульфита натрия, пирувата натрия и гемина нейтрализует токсические субстанции, которые могут образовываться в культуральной среде под действием кислорода, и позволяют обходиться без микроаэробной атмосферы. Лизированная кровь необходима для нейтрализации присутствующих в среде антагонистов триметоприма.

Селективность этапа обогащения оптимизируется селективной добавкой (Артикул 06-131-LYO): ванкомицин активен в отношении грамположительных микроорганизмов. Цефоперазон в основном действует на грамотрицательные бактерии. Триметоприм эффективен в отношении широкого круга грамположительных и грамотрицательных клеток, а циклогексимид или амфотерицин В являются эффективными фунгицидами.

Приготовление

Растворить 13,8 г порошка в 500 мл дистиллированной воды, при необходимости нагреть. Стерилизовать автоклавированием 15 минут при температуре 121ºС. Остудить до 47-50°C, асептически добавить 25 мл лизированной лошадиной крови и 1 флакон Селективная добавки Campylobacter Bolton (Артикул 06-131-LYO). Хорошо смешать. Приготовленную среду разлить в соответствующие контейнеры.

Примечание: Если бульон для обогащения приготовлен заранее, его можно хранить при комнатной температуре не более 4 часов или в темноте при температуре 3 ± 2°C не более 7 дней.

Техника посева

Образец вносят в среду в количестве (по массе или объему), в девять раз меньшем объема селективного обогатительного бульона Bolton, чтобы получить соотношение тестируемый образец/среда 1:10 (в/о или о/о), и гомогенизируют.

Селективный бульон для обогащения Bolton не требует инкубации в микроаэробных условиях, но должен применяться в плотно завинчивающихся контейнерах, заполненных так, чтобы сверху оставалось свободное пространство высотой менее 20 мм.

Инкубируют исходную суспензию при температуре 37°C в течение 4-6 часов, затем при 41,5°C в течение 44 ± 4 часов.

Методы выделения и идентификации см. в ISO или Руководстве по бактериологическому анализу (BAM).

Хранение

Среда предназначена только для использования в лабораториях. Храните среду в банке с плотно закрытой крышкой, в темном, сухом, прохладном месте (при температуре от +4°C до 30°C и влажности <60%)

Контроль качества

Селенитовый бульон — среда обогащения с селективными свойствами, предназначенная для выделения патогенной бактерий рода сальмонелла (лат. Salmonella). Она очень эффективна при необходимости обнаружить именно этот патогенный организм в числе других представителей кишечной микрофлоры. Среда используется как для клинической диагностики, так и в санитарных целях при проверке пищевых продуктов.

Общая характеристика

Селенитовый бульон готовится на основе порошка, представляющего собой гомогенизированную смесь различных компонентов состава. Цвет сухого материала может быть светло-желтым или кремовым, в зависимости от типа среды. Порошок обладает сыпучими свойствами.

Готовый селенитовый бульон представляет собой жидкую прозрачную среду светло-желтого цвета. Эта масса заливается в емкости, куда производится посев для дальнейшей инкубации.

Существует три основных вида селенитового бульона:

• среда в чистом виде — подходит для выделения сальмонелл как из клинического, так и из санитарного материала;
• с добавлением маннита (двухкомпонентный бульон) — предназначен для работы только с клиническим материалом;
• цистеин-селенитовая среда — может использоваться для выделения сальмонелл из патологического биоматериала пациента (кал, моча и др).

Эти типы немного отличаются компонентным составом и особенностями действия.

Основная задача селенитового бульона — способствовать накоплению сальмонелл, подавляя рост сопутствующей микрофлоры. Это дает возможность не только обнаружить патоген в материале, но и впоследствии пересеять его на агар. Среда была разработана Лейфлером, который первым обнаружил селективное действие селенита в отношении сальмонелл.

Состав

В состав селенитового бульона входят:

• гидролизат казеина;
• лактоза;
• фосфат натрия;
• гидроселенит натрия.

Селенит-цистеиновая среда, кроме этих компонентов, содержит L-цистеин и гидрофосфат натрия. Состав бульона с маннитом отличается тем, что вместо гидролизата казеина туда входит пептический перевар животной ткани. Лактоза в такой среде отсутствует, но зато есть маннит. Последний выступает в качестве ферментируемого субстрата и обеспечивает буферные свойства бульона.

Все компоненты порошка, кроме гидроселенита натрия, условно называют частью А, а селективное вещество — частью Б.

Принцип действия и свойства среды

Селенитовый бульон работает как накопительная среда с селективным действием. Избирательный эффект обеспечивается за счет токсичности селенита, который подавляет рост большинства микроорганизмов. При этом бактерии рода сальмонелла способны восстанавливать это соединение, тем самым устраняя токсический эффект для собственных клеток. Однако в результате реакции образуется щелочь, которая снижает пагубное влияние селенита на рост сопутствующей микрофлоры, в связи с чем возникает необходимость стабилизировать pH. Эту функцию выполняют бактерии, ферментирующие лактозу с образованием кислоты. Буферность среды обеспечивается фосфатом.

В двухкомпонентном бульоне pH стабилизируется за счет маннита. Среда с цистеином улучшает селективное действие в отношении сальмонелл. Такой бульон эффективен для контроля инфекционного фона у пациентов с неострой стадией заболевания или реконвалесцентов.

Проявление ростовых характеристик референтных штаммов в среде можно наблюдать по истечении 12-24 часов с момента начала инкубации. При этом сальмонеллы образуют бесцветные колонии.

Особенности приготовления

Приготовление среды осуществляют в два этапа. Вначале делают раствор с селективным компонентом из расчета 4 грамма селенита натрия на литр дистиллированной воды. Затем добавляют 19 грамм основного порошка (часть А). Раствор тщательно перемешивают и подогревают до полного растворения частиц, после чего заливают в стерильные пробирки.

При приготовлении важно следить за температурным режимом, поскольку среда неустойчива к перегреву. Стерилизацию бульона можно осуществлять только на водяной бане или же использовать струю пара. Автоклавирование среды категорически недопустимо.

Бульон для выделения энтерококков (энтерококкозель бульон) – обогатительная среда для выделения энтерококков из проб, содержащих многочисленную сопутствующую микрофлору. Многие микроорганизмы, такие как сапрофитные нейссерии, стафилококки, гемофилы, негемолитические стрептококки и некоторое количество энтеробактерий, ингибируются полностью или частично.

Казеиновый и соевый пептоны являются источниками питательных веществ, необходимых для роста микроорганизмов. Декстроза – ферментируемый углевод, источник углерода и энергии. Хлорид натрия поддерживает осмотический баланс. Цитрат натрия – дополнительный источник углерода. Азид натрия – ингибитор. Сульфит натрия при восстановлении образует H 2 S. L-цистин снижает окислительно-восстановительный потенциал за счет удаления кислорода, поддерживая низкое значение Eh. Кристаллический фиолетовый – индикатор pH.

Инокулировать и инкубировать 18−24 часа при 35°C в нормальной атмосфере. Рост энтерококков определяется по образованию гранулированного осадка на дне пробирки, причем находящаяся над ним жидкость – без осадка или слегка мутная. На этом этапе выполняется окрашивание по Граму и производится пересев штрихом на чашки с кровью (Агар триптиказеино-соевый (кат. № 1068) или Основа кровяного агара (кат. № 1108)) для определения типа гемолиза и выделения чистых культур. Для дифференциации стрептококков и пневмококков поместить диски с бацитрацином и оптохином в область посева на чашках с кровяным агаром и инкубировать в рекомендуемых условиях 18–24 часа при 35±2°C.

Провести окрашивание по Граму, каталазный тест и тест на растворимость в желчи с характерными колониями, взятыми из чашек с кровяным агаром или культурой, выросшей в бульоне.

Присутствие цепочек грамположительных кокков различной длины, ингибируемых бацитрацином в низкой концентрации, отрицательных по каталазе и нерастворимых в желчи или солях желчных кислот, является предварительной идентификацией бета-гемолитических стрептококков группы A. Окончательную идентификацию стрептококков можно осуществить с помощью других биохимических тестов, таких как гидролиз эскулина, гидролиз пирувата и т.п. Помимо этого можно провести серологическое типирование с использованием методов с антисыворотками по Лансфилду (Lancefield) или более традиционных методов коагглютинации по Эдвардсу и Ларсону (Edwards and Larson).

Микробиологический тест

Следующие результаты были получены при использовании среды на тестовых культурах после инкубации при 35±2°C и наблюдались через 18–24 часа.

Основа селективного бульона Болтона -

Bolton Selective Enrichment Broth (Base) for microbiology

Кат. №1.00068.0500

Упаковка - 500 г

Селективный накопительный бульон Болтона для выявления Campylobacter

Принцип действия

Селективный бульон Болтона содержит питательные вещества, которые способствуют выявлению даже поврежденных клеток кампилобактера. Не требуется создание микроаэрофильных условий. Внесение в среду селективной добавки ингибирует рост сопутствующей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры.

Состав (г/л)

Пептон из мяса 10,0; гидролизат лактальбумина 5,0; дрожжевой экстракт 5,0; хлорид натрия 5,0; кетоглутаровая кислота 1,0; пируват натрия 0,5; бисульфит натрия 0,5; карбонат натрия 0,6; гемин 0,01.

Приготовление

Растворить 13,8 г в 500 мл дистиллированной воды. Автоклавировать 15 мин при 121°С и охладить до 45°С. Добавить в асептических условиях 25 мл лизированной лошадиной крови и содержимое 1 флакона селективной добавки Bolton Broth Selective Supplement (Кат. N 1.00079.0001) к бульону Болтона. Тщательно перемешать и разлить бульон в стерильные флаконы с завинчивающимися крышками. После добавления образца свободный промежуток между завинчивающейся крышкой и уровнем бульона должен составлять приблизительно 2 см.

рН 7,4 ±0,2 при 25°С.

Готовая среда во флаконе имеет темно-красный или почти черный цвет.

Проведение анализа

Размешать 25 г образца в 225 мл селективного бульона Болтона и инкубировать на протяжении 4 часов при температуре 37°С.

Затем продолжить инкубацию при температуре 41,5°С на протяжении 14-44 часов.

Сделать пересев через 18 часов и 48 часов соответственно на Campylobacter Blood Free Selective Agar селективном агаре (Кат.№ 1.00070.0500), который не содержит кровь.

Прямой скрининг на наличие Campylobacter jejuni и c oli проводят с использованием экспресс-тестов Singlepath ® Campylobacter (Кат.№1.04143.0001).

Контроль качества.