Komplementa fiksācijas reakcijas mikrobioloģija. Komplementa saistīšanās reakcija. Komplementa saistīšanas tests (CFR) ir sarežģīts divpakāpju seroloģiskais tests. Galvenā eksperimenta iestatīšana RSC Borde - Zhangu

(RSK) ierosināja Dž. Borde un apmēram. Džangu. Reakcija ietver divas fāzes (10.-18. att.).

I fāzē (specifiskā) komplementa saistīšanās reakcija (CFR) vēlamais Ag (vai AT) reaģē ar diagnostisko antiserumu (vai Ag diagnosticum) un komplementu. Iegūtais Ag-AT komplekss saistās ar komplementu.

II fāzē (indikators) komplementa saistīšanās reakcija (CFR) nosaka brīvā komplementa klātbūtni, ievadot hemolītiskās sistēmas reakcijas vidē - aitu eritrocītus un tiem AT saturošu hemolītisko serumu. Ja Ag un AT neatbilst viens otram un neveido imūnkompleksus, tad komplementa fiksācija nenotiek. Tajā. Šajā gadījumā brīvais komplements mijiedarbojas ar hemolītiskās sistēmas sastāvdaļām, piestiprinoties pie eritrocītu-antieritrocītu AT kompleksa. Tā sekas - indikatoršūnu hemolīze ("lakas asiņu" parādība) - reakcija tiek uzskatīta par negatīvu.

Ja komplementa fiksācijas reakcijas (RCC) I fāzē AT un Ag atbilst viens otram, tad iegūtie imūnkompleksi saistās ar komplementu, eritrocītu iznīcināšana pēc hemolītiskās sistēmas ievadīšanas netiek novērota, un reakcija tiek uzskatīta par pozitīvu. Galvenie RSC trūkumi: sarežģītība (ietver 5 komponentus), dažu komponentu labilitāte [tie jāsagatavo tieši pirms reakcijas (komplements) vai vairākas dienas iepriekš (aitas eritrocīti)] un iespējamās antikomplementārās īpašības serumos un Ag. Tomēr CSC izmanto daudzu slimību diagnostikā, piemēram, sifilisa diagnostikā (Wassermann reakcija).

RSK raksturo augsta jutība un specifiskums, un to izmanto:

1) seroloģiskā diagnoze infekcijas slimības(R. Wasserman - ar sifilisu, R. Borde-Zhangu - ar hronisku gonoreju utt.);

2) baktēriju un citu mikrobu identificēšana.

RSC attiecas uz sarežģītām seroloģiskām reakcijām, kurās bez AG un AT ir arī hemolītiskā sistēma (r. hemolysis), kas atklāj reakcijas rezultātu.

RSK tiek veikts divos posmos, piedaloties divām sistēmām:

1) pirmā sistēma - AG + AT + komplements - izraisa komplementa saistīšanos, ja AT atbilst AG. AT un AG neatbilstības gadījumā komplements paliek brīvs;

otrā sistēma (indikators) - hemolītiskais serums (hemolizīni) + eritrocīti - parāda reakcijas iznākumu pirmajā sistēmā: pozitīva reakcijas rezultāta gadījumā pirmajā sistēmā (AG + AT + komplementa kompleksa veidošanās) , otrajā sistēmā hemolīze nenotiks komplementa trūkuma dēļ (eritrocīti nosēžas mēģenes apakšā). Ja pirmajā sistēmā ir negatīvs rezultāts, otro pavada hemolīze, jo veidojas eritrocītu + hemolizīnu + komplementa komplekss (sk. 3. pielikuma 7. un 8. attēlu).

Reakcijas sastāvdaļas:

1) testa serums (iepriekš inaktivēts, karsējot 56 0 C temperatūrā 30 minūtes);

2) antigēns (izgatavots no nogalinātu mikrobu suspensijām, mikrobu lizātiem, pilnajiem antigēniem, haptēniem, audu lipīdu ekstraktiem);

3) papildināt;

4) hemolītiskais serums;

5) 3% aitu eritrocītu suspensija;

6) sāls šķīdums;

7) kontroles serums.

Papildināt. Kā papildinājums RSC tiek izmantotas svaigas un žāvētas sūkalas. jūrascūciņa, jo jūrascūciņas asinīs komplementu satur lielākā daļa un atrodas pastāvīgi nekā citiem dzīvniekiem. Pirms RSK iestatīšanas hemolīzes reakcijā jāveic komplementa titrēšana (aitas eritrocīti, hemolītiskais serums, komplements, sāls šķīdums) un darba devas noteikšana.

Komplementa titrs- augstākais komplementa atšķaidījums, kas hemolītiskā seruma klātbūtnē izraisa pilnīgu eritrocītu līzi.

Komplementa darba deva- papildinājuma daudzums, kas ir par 25% lielāks nekā domuzīme.

Hemolītiskais serums ir sagatavots, imunizējot trušus ar 50% aunu eritrocītu suspensiju. Iegūtais serums tiek inaktivēts, karsējot 56 0 C. Nosaka titru un darba devu.

Seruma titrs- maksimālais seruma atšķaidījums, kas komplementa klātbūtnē izraisa pilnīgu eritrocītu līzi. Kā darba devu hemolītisko serumu ņem trīskāršā titrā.

RSC Borde-Gangu

Reakcija tiek veikta, lai diagnosticētu hronisku gonoreju, lai noteiktu antivielas pret gonokoku.

RSC ir iesaistītas 2 sistēmas: galvenā sistēma ir testa serums, antigēns, komplements, bet palīgsistēma, indikators jeb hemolītiskā sistēma ir hemolītiskais serums un aitas eritrocīti.

Ja pirmajā sistēmā veidojas specifisks antigēns + antivielu komplekss, tad komplements adsorbējas (apvieno ar šo kompleksu) un otrajā sistēmā hemolīze nenotiek.

Reakcijai ir nepieciešams:

1. Testa serums, kas iegūts no asinīm, kas ņemtas, punkējot pacienta kubitālo vēnu. Pēc asins recēšanas serumu aspirē atsevišķā mēģenē un 30 minūtes inaktivē 56 0 C temperatūrā ūdens vannā.

2. Antigēns - nogalinātu gonokoku suspensija.

3. Aitu eritrocītus iegūst no sterilām defibrinētām asinīm. Tos mazgā, 3 reizes centrifugējot ar jaunām fizioloģiskā šķīduma porcijām. Reakcijā tiek izmantota 3% eritrocītu suspensija.

4. Hemolītisko serumu sagatavo iepriekš, imunizējot trušus ar aunu eritrocītiem. Serums tiek titrēts pirms lietošanas.

5. Papildinājums - svaigs jūrascūciņas serums. No jūrascūciņas sirds ar šļirci sūc asinis, pēc sarecēšanas atdala serumu. Pirms eksperimenta komplementa darba devu titrē. Lai to izdarītu, ņem komplementa galveno atšķaidījumu 1:10 un ielej mēģenēs no 0,1 līdz 0,5, pēc tam tilpumu katrā mēģenē noregulē ar fizioloģisko šķīdumu līdz 1,5 ml.

Tajā pašā laikā tiek sagatavota hemolītiskā sistēma - hemolītiskais serums, kas atšķaidīts trīskāršā titrā + 3% aunu eritrocītu suspensija. Abas sastāvdaļas dažādos tilpumos un 30 minūtes inkubē termostatā (maisījuma sensibilizācija), pēc tam maisījumu pievieno 1 ml mēģenēs un ievieto termostatā uz 30 minūtēm. 3 mēģenes kalpo kā kontrole:

1. 1 ml hemolītiskās sistēmas + 1,5 ml fizioloģiskā šķīduma;

2. 0,5 ml komplementa 1:10 + 0,5 ml eritrocītu suspensijas + 1,5 ml fizioloģiskā šķīduma.

Komplementa titrs ir minimālais daudzums, pie kura joprojām notiek hemolīze. Lai noteiktu reakciju, tiek ņemta komplementa darba deva, kas palielināta pret titru par 20-25%, t.i., parasti komplementa daudzums, kas atrodas priekšpēdējā mēģenē ar hemolīzi. Komplementa devas palielināšana ir nepieciešama, jo reakcijā komplementa aktivitāti var nedaudz nomākt citas reakcijas sastāvdaļas (antigēns, serums).

Paziņojums par galveno eksperimentu RSC Borde - Zhangu.

Sākumā inaktivētu un atšķaidītu 1:5 testa serumu ielej 2 mēģenēs. Pēc tam antigēnu ielej 1. mēģenē, otrajā fizioloģiskajā šķīdumā. Pēc tam visām mēģenēm pievieno komplementa darba devu.

Pēc sastāvdaļu sajaukšanas statīvu ar mēģenēm ievieto termostatā 37 0 C temperatūrā uz 30 minūtēm (karstā iesiešana). Ar aukstu iesiešanu statīvu ar mēģenēm ievieto ledājā -4 0 C temperatūrā uz 18 stundām. Pēc turēšanas termostatā visām mēģenēm pievieno hemolītisko sistēmu. Reakciju ievieto 0,5 ml tilpumā. Mēģenes atkal ievieto termostatā uz 2 stundām, pēc tam tiek veikta iepriekšēja rezultātu reģistrācija. Caurules paliek telpas temperatūra, un nākamajā dienā tiek atzīmēts gala rezultāts.

Reakcijas intensitātes pakāpe tiek novērtēta plusos. Pilnīga hemolīzes aizkavēšanās - četri plusi (++++), nepilnīgi - trīs, un viens pluss. Pilnīgu hemolīzi norāda ar mīnusa zīmēm (-).

RSK Vasermans

To izmanto sifilisa diagnosticēšanai, lai noteiktu antivielas, kā arī noteiktu specifiskas terapijas efektivitāti. Tas ir balstīts uz Borde-Gangou komplementa fiksācijas reakcijas principu. Būtiska atšķirība Vasermana reakcijā ir antigēna nespecifiskums: kā antigēni tiek izmantoti lipoīdu ekstrakti no normāliem dzīvnieku orgāniem.

Lai iestatītu Vasermana reakciju, nepieciešams pacienta serums, diagnostiskie krusteniski reaģējošie antigēni Nr.1 ​​un Nr.2, komplements, hemolītiskais serums, auna eritrocīti, fizioloģiskais šķīdums.

Diagnosticum Nr.1 ​​- specifisks, treponemāls.

Diagnosticum Nr.2 ir nespecifisks kardiolipīna antigēns, kas ir ļoti attīrīts liellopu sirds ekstrakts ar nemainīgu lipoīdu ķīmisko sastāvu. Lipoīdi, kas iegūti no sirds ķīmiskais sastāvs ir tuvi treponema pallidum lipoīdiem, tāpēc, lai arī tie nav specifiski, tie fiksē antivielas pret spirohetām. Šos antigēnus ražo centralizēti un izmanto reakcijā, atšķaidot atbilstoši titram, kas norādīts uz etiķetes.

Vienlaikus ar galveno eksperimentu tiek ievietotas 2 kontroles: ar acīmredzami negatīviem un pozitīviem serumiem.

Komplementa fiksācijas tests (CFR) ir seroloģisks tests, kas ir salīdzināms ar jutību pret nokrišņu, aglutinācijas un neitralizācijas metodēm. RSK ir metode, kurā tiek izmantotas divas antigēnu-antivielu sistēmas:

pirmais ir specifisks;

otrais ir indikators (hemolītisks).

RSC nepieciešami 5 komponenti: diagnostiskais antigēns, diagnostiskās antivielas, indikatorantigēns (aitas eritrocīti), indikatorantivielas (trušu hemolizīni), komplements.

Specifisko antigēna un antivielu mijiedarbību pavada komplementa fiksācija. Iegūtais komplekss vizuāli neizpaužas. Hemolītisko sistēmu izmanto kā indikatoru. Hemolītiskais serums sensibilizē eritrocītus pret komplementa darbību, kura klātbūtnē notiek eritrocītu līze (hemoloze). Ja hemolīzes nav, tad komplementu saista pirmā sistēma, un tāpēc tajā esošais antigēns atbilst antivielai - pozitīva atbilde. Ja antiviela nesakrīt ar antigēnu, komplekss neveidojas un komplements, paliekot brīvam, savienojas ar otro sistēmu, izraisot hemolīzi – reakcija ir negatīva.

Lai iestatītu RSC, visas reakcijas sastāvdaļas tiek sagatavotas un titrētas pirms galvenā eksperimenta.

Serumu (pacientu vai diagnostisko) reakcijas priekšvakarā 30 minūtes karsē ūdens vannā 56ºС temperatūrā, lai inaktivētu savu komplementu. Dažiem serumiem, īpaši no imunizētiem dzīvniekiem, piemīt antikomplementa īpašības, t. spēja saistīt komplementu, ja nav homologa antigēna. Antikomplementaritāte tiek novērsta, apstrādājot tos ar oglekļa dioksīdu, karsējot 57-58ºС temperatūrā, vienreizēju sasaldēšanu -20ºС vai -70ºС temperatūrā un nogulsnes atdalot centrifugējot, pievienojot komplementa serumu 1:10 seruma tilpumā un karsējot. pēc inkubācijas aukstumā 18-20 stundas Lai novērstu serumu antikomplementaritāti, tos uzglabā liofilizētā veidā vai sasaldē zemā temperatūrā.

Par CSC antigēnu var kalpot dažādu nogalinātu mikroorganismu kultūras, to lizāti, baktēriju sastāvdaļas, patoloģiski izmainīti un normāli orgāni, audu lipīdi, vīrusi un vīrusus saturoši materiāli. Daudzus mikrobu antigēnus ražo rūpnieciski. Antigēnu antikomplementaritāte tiek novērsta, izmantojot tādas metodes kā termolīze (vairākkārtēja sasaldēšana un atkausēšana), apstrāde ar tauku šķīdinātājiem (ēteris, hloroforms, acetons), spirti (metanols, etanols) utt.

Kā papildinājumu izmanto jūrascūciņu serumu, kas ņemts tieši pirms eksperimenta; var izmantot arī sauso komplementu. Lai iegūtu bāzes šķīdumu turpmākai titrēšanai, komplementu atšķaida attiecībā 1:10 ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu.

Aitu eritrocītus izmanto 3 suspensiju veidā izotoniskā nātrija hlorīda šķīdumā. Asinis (100-150 ml) ņem no jūga vēna, ievieto sterilā burkā ar stikla pērlītēm, defibrinē kratot 10-15 minūtes un filtrē cauri 3-4 sterilas marles kārtām, lai noņemtu fibrīnu. Eritrocītus 3 reizes mazgā ar izotonisko nātrija hlorīda šķīdumu, pievienojot to eritrocītu nogulsnēm līdz sākotnējam asins tilpumam. Eritrocītus var uzglabāt 5-6 dienas 4-6ºС temperatūrā. Eritrocītu glabāšanas laiks palielinās, ja tos konservē ar formalīnu.

Hemolītisko serumu CSC iegūst šādi Trušus imunizē, ievadot tiem auss vēnā 50% nomazgātu aitas eritrocītu suspensiju (1 ml 4-6 reizes katru otro dienu). Seruma paraugs tiek iegūts 7 dienas pēc pēdējās injekcijas. Ja seruma titrs nav zemāks par 1:1200, tiek veikta asins nolaišana. Serumu karsē 30 minūtes 56ºС temperatūrā. Lai novērstu baktēriju augšanu, hemolītiskajam serumam pievieno konservantu (mertiolāts 1:10000 vai 1 borskābe).

Hemolītiskā sistēma sastāv no hemolītiskā seruma, kas sajaukts vienādos tilpumos (ņemts trīskāršā titrā) un 3 aunu eritrocītu suspensijas. Lai sensibilizētu eritrocītus ar hemolizīniem, maisījumu 30 minūtes tur termostatā 37ºС temperatūrā.

Hemolītiskā seruma titrēšana. Serumu titrē, apvienojot 0,5 ml tā (atšķaidījumos 1:600, 1:1200, 1:1600, 1:3200 utt.) ar 0,5 ml 3 eritrocītu suspensijas un 0,5 ml svaiga komplementa atšķaidījumā 1:10. . Reakcijai paredzētā maisījuma tilpums kontroles mēģenēs tika noregulēts līdz 1,5 ml, pievienojot izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu. Reakcijas rezultāti tiek ņemti vērā pēc 1 stundu ilgas inkubācijas 37ºС temperatūrā. Hemolītiskā seruma titrs ir tā augstākais atšķaidījums, kas izraisa pilnīgu hemolīzi. Serums tiek uzglabāts liofilizētā veidā.

Titrēšanas shēma hemolītiskajam serumam

Papildiniet titrēšanu. Pirms eksperimenta bāzes komplementa šķīdumu (1:10) ielej vairākās mēģenēs no 0,05 līdz 0,5 ml un pievieno katram izotoniskajam nātrija hlorīda šķīdumam, palielinot šķidruma tilpumu līdz 1,5 ml. Mēģenes ievieto termostatā 37ºC temperatūrā uz 45 minūtēm, tad tām pievieno hemolītisko sistēmu un 30 minūtes tur termostatā, pēc tam nosaka komplementa titru.

Eksperimentam tiek ņemta komplementa darba deva (0,5 ml tilpumā), kas ir par 20-30% lielāka par titru.

Papildināt titrēšanas shēmu

Termostats 37ºС 45 min

Termostats 37ºС 30 min

Antigēna titrēšana. CSC izmantotie antigēni var adsorbēt kādu komplementa daudzumu, t.i. piemīt antikomplementāras īpašības. Tāpēc pirms eksperimenta antigēnus titrē komplementa darba devas klātbūtnē. Mazākā mērā antikomplementārās īpašības izpaužas specifiskos antigēnos, kas ražoti ražošanas procesā. To titru nosaka nevis pirms katra eksperimenta, bet reizi mēnesī, ņemot vērā tā samazināšanās iespēju uzglabāšanas laikā.

Lai noteiktu antigēna titru, to ielej vairākās mēģenēs dilstošā daudzumā no 0,5 līdz 0,05 ml, tilpumu tajās palielinot līdz 1 ml, pievienojot nātrija hlorīda šķīdumu. Pēc tam katrai mēģenei pievieno 0,5 ml komplementa darba devas un ievieto termostatā uz 1 stundu 37ºС temperatūrā. Pēc tam visām mēģenēm pievieno 1 ml hemolītiskās sistēmas, tās atkal 1 stundu inkubē termostatā un ņem vērā reakcijas rezultātus.

Antigēna titrs tiek uzskatīts par mazāko daudzumu, kurā notiek pilnīga hemolīze. CSC tiek izmantota antigēna darba deva, kas ir aptuveni 1/2-1/3 titra. Antigēni, kuru klātbūtnē komplementa titrs samazinās par vairāk nekā 30%, reakcijai nav piemēroti.

Antigēnu titrēšanas shēma

Termostats 37ºС uz 1 stundu

Termostats 37ºС uz 1 stundu

RSC galvenās pieredzes veikšana. Kopējais reakcijas sastāvdaļu tilpums ir 2,5 ml, katras no tām darba devas tilpums ir 0,5 ml. Serumu atbilstošā atšķaidījumā, antigēnu un komplementu ievada pirmajā mēģenē, serumu atbilstošā atšķaidījumā, komplementu un izotonisko nātrija hlorīda šķīdumu (seruma kontrole) otrajā mēģenē, antigēnu, komplementu un izotonisko nātrija hlorīda šķīdumu (antigēna kontrole) trešā caurule. Tajā pašā laikā tiek sagatavota hemolītiskā sistēma, sajaucot 2 ml hemolītiskā seruma trīskāršā titrā (attiecībā pret instrukcijā norādīto) un 3% aitas eritrocītu suspensiju (attiecībā pret sākotnējo asins tilpumu). Mēģenes tiek turētas termostatā 37ºС temperatūrā 1 stundu, pēc tam pirmajām 3 mēģenēm (pirmā sistēma) pievieno 1 ml hemolītiskās sistēmas (otrā sistēma). Pēc sastāvdaļu rūpīgas sajaukšanas mēģenes atkal ievieto termostatā uz 1 stundu 37ºС temperatūrā.

RSC galvenā eksperimenta veikšanas shēma

Termostats 37ºС uz 1 stundu

Termostats 37ºС uz 1 stundu

Reakcijas rezultāti tiek ņemti vērā sākotnēji - pēc mēģenes izņemšanas no termostata un visbeidzot - pēc 15-18 stundu turēšanas ledusskapī vai istabas temperatūrā.

Galīgajā uzskaitē reakcijas intensitāte tiek izteikta plusos: (++++) - krasi pozitīva reakcija, ko raksturo pilnīga hemolīzes aizkavēšanās (šķidrums mēģenē ir bezkrāsains, visi eritrocīti nosēžas apakšā ); (+++, ++) - pozitīva reakcija, kas izpaužas kā šķidruma krāsas palielināšanās hemolīzes dēļ un eritrocītu skaita samazināšanās nogulumos; (+) - vāji pozitīva reakcija (šķidrums ir intensīvi krāsots, mēģenes apakšā ir neliels eritrocītu daudzums). Ar negatīvu reakciju (-) tiek novērota pilnīga hemolīze, šķidrumam mēģenē ir intensīva rozā krāsa (lakas asinis).

Ir ierosinātas vairākas RSC modifikācijas, kurām raksturīga paaugstināta jutība un mazāks izmantoto sastāvdaļu daudzums. Tā, piemēram, virusoloģiskajos pētījumos CSC sastāvdaļu daudzums aukstumā ir 1 ml. Pilināšanai RSC ņem 1 pilienu seruma + 1 pilienu antigēna + 1 pilienu komplementa + 2 pilienus hemolītiskās sistēmas.

Komplimentu saistīšanas reakcija ir atradusi visplašāko izplatību mikrobioloģiskajā un seroloģiskajā diagnostikā.

Ar RSK palīdzību asins serumā tiek noteiktas komplementu fiksējošas antivielas pacientiem ar sifilisu, iekšņiem, hronisku gonoreju, riketsiozi, vīrusu slimībām u.c.

RSC ir īpaši interesants klīniskajā imunoloģijā. Reakciju izmanto dažādu limfocītu apakšpopulāciju izolēšanai, HLA antigēnu noteikšanai uz trombocītiem, transplantētiem limfoblastiem, fibroblastiem, audzēja šūnām un trombocītiem specifiskiem antigēniem, kā arī atbilstošām antivielām.

AT Reakcija balstās uz divām parādībām - bakteriolīzi un hemolīzi. Papildinājums ir iesaistīts to izpausmē. Tāpēc RSC tiek izmantotas divas komponentu sistēmas: 1) nodrošina bakteriolīzes fenomenu un tiek izmantota diagnostikas nolūkos; 2) hemolītiskais, indikators, palīglīdzeklis; ļauj noteikt, vai papildinājums ir vai nav saistīts pirmajā sistēmā (sk. krāsu shēmu I attēlā). Iepriekš kā antigēns tika izmantota baktēriju suspensija, tāpēc pirmo sistēmu sauca par bakteriolītisko (pozitīvos gadījumos notika baktēriju līze).

RSC iestatīšana tiek veikta divos posmos. Pirmajā posmā tiek sagatavota bakteriolītiskā sistēma: mēģenēs sajauc 0,5 ml testa seruma ar antigēnu, pievieno komplementu stingri noteiktā devā (titrā). Antigēna - seruma-komplementa (bakteriolītiskās sistēmas) maisījumu tur ūdens vannā (vai termostatā) 20 ... 40 minūtes 37 ... 38 "C. Komponentu mijiedarbības rezultāts mēģenē. ir neredzams, šķidrums paliek caurspīdīgs un bezkrāsains.Lai noteiktu, kontaktējies Ja komplements atrodas bakteriolītiskajā sistēmā, tiek veikta otrā reakcijas stadija: mēģenēs tiek pievienotas hemolītiskās sistēmas sastāvdaļas - mazgāti aitas eritrocīti un inaktivēts hemolītiskais serums, kā parādīts shēmā.Visas bakteriolītiskās sistēmas sastāvdaļas sakrata, lai sajauktos mēģenē, ievieto ūdens vannā 37... 38 "C uz 20...40 min. Pēc tam pievieno gemoloģiskās sistēmas sastāvdaļas, visu otrreiz sakrata un atkal ievieto ūdens vannā uz 10–15 minūtēm.

Provizoriskais rezultāts. Ja serumu iegūst no slima dzīvnieka, tad tajā ir antivielas, kas apvienojas ar konkrētu antigēnu. Komplements saistās ar šo kompleksu (antigēns - antiviela) - hemolīze nenotiek, rezultāts ir pozitīvs.

Vesela dzīvnieka serumā antivielu nav: antigēna-antivielu komplekss neveidojas, komplements bakterioloģiskajā sistēmā nesaistās. Pievienojot eritrocītus un hemolizīnu (tas ir antigēns un antiviela savā starpā), komplements reaģē ar šo kompleksu – notiks hemolīze, rezultāts ir negatīvs (sk. krāsu II att.).

Rezultāta gala atskaite. Mēģenes atstāj istabas temperatūrā 15...20 stundas.Ja serums bakteriolītiskajā sistēmā bija no slima dzīvnieka, mēģenē veidojas specifisks antigēna-antivielu komplekss, kas adsorbē (saista) visu pievienoto komplementu. Līdz ar to otrajā, hemolītiskajā sistēmā, hemolīze nenotiks, eritrocīti nosēdīsies mēģenes apakšā, un supernatants ir caurspīdīgs. RSC rezultāts ir pozitīvs.

Ja testa serumā nav specifisku antivielu pret izmantoto antigēnu (gadījumos, ja serums ir no vesela dzīvnieka), antigēna-antivielu komplekss bakteriolītiskajā sistēmā neveidojas un līdz ar to šajā sistēmā nav komplementa. adsorbēts, bet paliek brīvs. Pievienojot hemolītiskās sistēmas komponentus (reakcijas otrajā fāzē), komplements mijiedarbojas ar otro kompleksu (hemolizīns-eritrocīti), notiek eritrocītu hemolīze - neveidojas nogulsnes, šķidrums mēģenē ir lakas sarkans. . RSK rezultāts ir negatīvs.

RSK. pielietojums: 1) specifisku antivielu noteikšanai slima dzīvnieka serumā (brucelozes, peripneimonijas, dziedzera, leptospirozes, tripanosomiāzes u.c. diagnostikā); 2) noteikt specifisku antigēnu (baktēriju vai vīrusu) testa materiālā specifiska imūnseruma klātbūtnē.

Lai iestatītu RSK, jābūt: pētniecībai saņemtiem seruma paraugiem; divi serumi, zināmi pozitīvi (standarta, kas nodrošina pozitīvu rezultātu) un divi normāli serumi. Visi serumi atšķaidījumā 1:10 tiek inaktivēti 56...58 °C 30 minūtes; antigēns atšķaidījumā atbilstoši titram; komplements, kas atšķaidīts saskaņā ar noteikto titru titrēšanas laikā bakteriolītiskā sistēmā; hemolizīns darba titrā; aunu eritrocīti (I: 40); fizioloģiskais šķīdums, graduētas pipetes, mēģenes, statīvi, ūdens vanna 37...38 °C.

Pirms RSC uzstādīšanas aitas asinis defibrinē, eritrocītus mazgā ar fizioloģisko šķīdumu, centrifugējot, līdz supernatants ir pilnībā caurspīdīgs, kas tiek noņemts ar sūkšanu, un izgulsnētos eritrocītus atšķaida ar fizioloģisko šķīdumu 1:40 (2,5%). Antigēnu atšķaida saskaņā ar titru, ko uz etiķetes norāda biofabrika. Pirms RSK iestatīšanas hemolizīns un komplements tiek titrēti.

CSC antigēnu sagatavo biofabrikās. Parasti tie ir iznīcinātu mikrobu suspensiju (vai vīrusu saturošu audu) ekstrakti. Antigēniem nedrīkst būt hemolītiska iedarbība, kas tiek kontrolēta reakcijas laikā (mēģenē ielej 1 ... 2 antigēna devas un 0,5 ml eritrocītu suspensijas: nedrīkst būt hemolīzes). Uz ampulas ar antigēnu biofabrika norāda, ka tā ir paredzēta RSK (sapny, bruceloze vai cita). Uz iepakojuma ir norādīts partijas numurs, izgatavošanas datums, derīguma termiņš, antigēna aktivitāte, tas ir, kādā atšķaidījumā tas jāizmanto, iestatot RSK (1:100, 1:150 utt.). Dažās slimībās citi materiāli kalpo kā antigēni; piemēram, peripneimonijas diagnosticēšanai liellopiem CSC antigēns ir eksperimentāli subkutāni vai intrapleurāli inficēta teļa limfa. Ilgstoši uzglabājot antigēnus, to titru vēlreiz pārbauda laboratorijā pēc īpašas titrēšanas shēmas.

Pētījumam saņemtos testa serumus atšķaida ar fizioloģisko šķīdumu 1:5 vai 1:10, inaktivē, karsējot ūdens vannā, lai 30 minūtes iznīcinātu savu komplementu 56...58 °C temperatūrā (ēzeļu, mūļu, zirgēzeļu serumi - 61 ° C temperatūrā).

Hemolizīnu gatavo biofabrikās, trušus hiperimunizējot ar mazgātiem auna eritrocītiem. Lai to izdarītu, trušiem 4...5 reizes ar 2...3 dienu intervālu intravenozi injicē 40...50% eritrocītu suspensiju. Nedēļu pēc pēdējās injekcijas no trušiem ņem asinis, serumu sterili atsūc, inaktivē, konservē ar glicerīnu 1:1 vai 0,5% fenola, titrē, ielej ampulās. Laboratorijās pirms RSK iestatīšanas tos vēlreiz titrē.

Hemolizīna titrēšanas shēma. Sagatavo: i) komplementa atšķaidījumu 1:20; 2) hemolizīns 1:100 (0,2 ml hemolizīna + 9,8 ml fizioloģiskā šķīduma); 3) aitu eritrocītu suspensija 1:40; 4) fizioloģiskais NaCl šķīdums.

Lai iestatītu titrēšanas reakciju, statīvā ievieto divas mēģeņu rindas - viena palīgierīce tikai hemolizīna atšķaidījumu sagatavošanai, otra - pašai titrēšanai. Katras rindas pirmajai mēģenei pievieno sākotnējo hemolizīna atšķaidījumu 1:100 un pēc tam veic sērijveida atšķaidīšanu. Visas mēģenes sakrata un ievieto ūdens vannā 37...38°C uz 10...15 minūtēm. Rezultāta uzskaite: šajā piemērā mazākais daudzums (vai tā lielākais atšķaidījums), kas nodrošināja pilnīgu hemolīzi, ir 1:2000, t.i., tas ir tā faktiskais titrs. Darba titrs ir 2 reizes koncentrētāks - 1:1000.

0,5 ml (norādīts ar bultiņām) katra atšķaidījuma no pirmās rindas mēģenēm pārnes uz atsevišķām otrās rindas mēģenēm. Visām otrās rindas mēģenēm pievienojiet 0,5 ml komplementa (1:20), 0,5 ml auna eritrocītu (2,5% suspensija vai 1:40) un 1 ml fizioloģiskā šķīduma, lai šķidruma tilpums katrā flakonā būtu 2,5 ml.

Piezīme. Pamatojoties uz to, ka RSC galīgajā iestatījumā piedalīsies 5 komponenti pa 0,5 ml, kas veidos 2,5 ml tilpumu, šis tilpums tiek ievērots visa darba laikā.

Caurules sakrata un ievieto ūdens vannā 10-15 minūtes. Hemolīze galvenokārt notiks mēģenēs ar augstu hemolizīna saturu (tā mazākais atšķaidījums ir 1:500, 1:1000...). Mazāko hemolizīna daudzumu (tā augstāko atšķaidījumu), kas šajos apstākļos izraisīja pilnīgu eritrocītu hemolīzi, sauc par ierobežojošais (faktiskais) titrs hemolizīns. Turpmākam darbam hemolizīns tiek izmantots 2 reizes koncentrētāk, tas ir, dubultā daudzumā, dubultā titrs, ko sauc. darba nosaukums. Piemēram, ja faktiskais titrs ir I:2500 (vai 1:2000), tad darba titrs atbilst atšķaidījumam 1:1250 (vai 1:W00).

Komplements ir svaiga seruma, limfas, audu šķidrumu neatņemama sastāvdaļa dažādi veidi dzīvnieki (un cilvēki); atklāja Buhners (1889). Kukaiņiem komplementa nav. Komplements ir proteīna rakstura, sarežģītas struktūras viela, ko ātri inaktivē karsējot, ilgstoši uzglabājot, pakļaujot ultravioletajam starojumam, spēcīgai kratīšanai, filtrējot caur keramikas filtriem, pievienojot kaolīnu, skābes, sārmus, spirtu, acetonu, hloroformu, destilēts. ūdens, baktēriju suspensija utt. Komplementu var konservēt, pievienojot 5 g nātrija sulfāta, 4 g borskābes uz 100 ml jūrascūciņas seruma. Papildinājuma darbība tiek uzturēta līdz sešiem mēnešiem. Labākais veids konservēšana - žāvēšana vakuumā zemā temperatūrā (liofilizācija). Aizzīmogotās ampulās šādā stāvoklī tas tiek uzglabāts divus gadus. Pirms katras RSK ražošanas komplementa aktivitāti pārbauda titrējot, tas ir, nosaka tā titru - optimālo daudzumu, kas nepieciešams šai reakcijai. Komplementu titrē divreiz: hemolītiskajā un bakteriolītiskajā sistēmā.

Priekš komplementa titrēšana hemolītiskajā sistēmā tiek sagatavoti komponenti: komplements atšķaidījumā 1:20 (1 ml komplementa + 19 ml fizioloģiskā šķīduma); hemolizīns, atšķaidīts atbilstoši darba titram; mazgātu aitu eritrocītu suspensija (1:40), sāls šķīdums. Mēģenes ievieto statīva un tajās ar graduētu pipeti ieber dažādus komplementa daudzumus ar intervālu 0,03 ml (0,13; 0,16; 0,19; 0,22 ..: līdz 0,43 ml). Pēc tam pievienojiet atlikušās sastāvdaļas (57. att.). Visas mēģenes sakrata un ievieto ūdens vannā 37...38 "C uz 10...15 minūtēm un rezultātu pieraksta.

Rezultāta uzskaite: par komplementa titru ņem mazāko komplementa daudzumu, kas nodrošināja pilnīgu hemolīzi (šajā piemērā 0,25 ml).

Titrēšanas rezultāts tiek ņemts vērā mēģenēs ar vislielāko komplementa saturu, kur pirmām kārtām sagaidāma hemolīze. Tiek saukts mazākais komplementa daudzums, kas šajos apstākļos nodrošina pilnīgu eritrocītu hemolīzi komplementa titrs hemolītiskajā sistēmā.

Priekš komplementa titrēšana bakteriolītiskajā sistēmā nepieciešams, lai darba titrā būtu visas reakcijas sastāvdaļas: komplements (1:20), eritrocīti (1:40), hemolizīns, divi pozitīvi un divi normāli serumi, specifisks antigēns. Serumus atšķaida ar fizioloģisko šķīdumu 1:10, inaktivē 30 minūtes pie 56...58 X. Katru serumu ielej divās rindās 0,5 ml mēģenēs. Komplements tiek pievienots pieaugošā daudzumā katras rindas mēģenēs, tāpat kā titrējot hemolītiskā sistēmā; sāciet ar daudzumu, kas ņemts kā titrs hemolītiskajā sistēmā, tad katrā nākamajā mēģenē devu palielina par 0,03 ml, ar fizioloģisko šķīdumu izlīdzinot tilpumu līdz 0,5 ml.

Pēc tam vienai mēģeņu rindai ar pozitīviem un normāliem serumiem pievieno 0,5 ml antigēna, bet katra seruma otrajai rindai pievieno 0,5 ml fizioloģiskā šķīduma. Visas mēģenes sakrata un ievieto ūdens vannā 30–40 minūtes. Pēc tam visām mēģenēm pievieno 0,5 ml hemolizīna un 0,5 ml eritrocītu, sakrata un ievieto ūdens vannā 10-15 minūtes. Mazākais komplementa daudzums, kas nodrošināja pilnīgu eritrocītu līzi abās mēģeņu rindās (ar antigēnu un bez antigēna) no diviem normāliem serumiem, vienā rindā (bez antigēna) no katra pozitīvā seruma un ar pilnīgu hemolīzes aizkavēšanos (neesamību) tiek sauktas pozitīvo serumu rindas ar antigēnu (tādās pašās komplementa devās). komplementa titrs, kas tiek izmantota RSC galvenās pieredzes formulēšanā diagnostikas pētījumos.

Galvenā RSC pieredze (faktiskais diagnostikas pētījums). Divas mēģeņu rindas ievieto plauktos atbilstoši pētāmo seruma paraugu skaitam. 0,5 ml katra inaktivētā seruma ielej divās mēģenēs: vienai pievieno antigēnu - 0,5 ml, otrai pievieno 0,5 ml sāls šķīduma (bez antigēna), un, pievienojot komplementu, tie veido bakternolītisko sistēmu un tad pievieno hemolītisko līdzekli.

Nepieciešamās sastāvdaļas: 1) testa serums, inaktivēts, atšķaidīts ar fizioloģisko šķīdumu 1:10; 2) specifisks antigēns, kas atšķaidīts atbilstoši biofabrikas norādītajam titram uz iepakojuma etiķetes; 3) komplements noteiktajā titrā; 4) hemolizīns darba titrā; 5) mazgātu aitas eritrocītu suspensija 1:40; 6) fizioloģiskais NaCl šķīdums. Testa serumus ielej divās testa mēģenes rindās. Jebkuram pārbaudīto serumu skaitam kā kontroles izmanto zināmos pozitīvos serumus (kas dod pozitīvu rezultātu) un normālos (no vesela dzīvnieka, kas dod negatīvu rezultātu).

Caurules ar bakteriolītiskās sistēmas sastāvdaļām sakrata, ievieto ūdens vannā uz 20...40 min 37...38°C. Otrās rindas bakteriolītiskās sistēmas caurules bez antigēna sakrata, ievieto ūdens vannā tādos pašos apstākļos.

Pēc tam hemolītiskās sistēmas komponentus pievieno visām pirmās un otrās rindas mēģenēm un otrreiz ievieto ūdens vannā uz 10...15 minūtēm. Visās otrās rindas mēģenēs bez antigēna notiek pilnīga hemolīze.

Līdz gala rezultāta iegūšanai mēģenes atstāj istabas temperatūrā 18 ... .

Reakcijas indikācijas mēģenēs ar testa serumu tiek uzskatītas par ticamām, ja nav hemolīzes mēģenēs ar pozitīviem serumiem un antigēnu, ar pilnīgu hemolīzi mēģenēs ar pozitīvu serumu bez antigēna un visās mēģenēs ar zināmu normālu serumu (att. 61).

Šī reakcija jāpievieno antigēna, komplementa, hemolizīna, eritrocītu kontrolei. Lai to izdarītu, atsevišķās mēģenēs ielej antigēnu ar aitu eritrocītiem; papildināt ar eritrocītiem bez hemolizīna; hemolizīns ar eritrocītiem bez komplementa; eritrocīti un sāls šķīdums. Tilpumu katrā mēģenē noregulē ar fizioloģisko šķīdumu līdz 2,5 ml. Mēģenes sakrata un uz 20 minūtēm ievieto ūdens vannā 37°C temperatūrā. Visām kontroles mēģenēm nedrīkst būt hemolīzes.

RSC rezultāts parasti izteikts krustiņos. Pozitīva reakcijas rezultāta rādītāji: + + + + (///) - pilnīga eritrocītu sedimentācija (nav hemolīzes), šķidrums virs nogulsnēm ir bezkrāsains, + + + (///) - šķidrums virs nogulumiem ir tikko manāmi dzeltenīgs. Apšaubāms reakcijas rezultāts: apakšā nosēdušos eritrocītu klātbūtne un daļēja virspusē esošā šķidruma iekrāsošanās kādas eritrocītu daļas līzes dēļ tiek apzīmēta ar + + - (++), tas ir, divi un divi un a puskrusti. Izteikta hemolīze (bez nogulsnēm) vai ar nelielām nogulsnēm (+) ir negatīvs rezultāts.

Ilgtermiņa komplementa saistīšanās reakcija (RDSC). Efektīvāka jutībā, atšķirībā no parastā klasiskā RSC. Reakcijas būtība ir tāda, ka bakteriolītiskā sistēma tiek uzturēta trīs dažādās temperatūras apstākļi: pēc sastāvdaļu sajaukšanas istabas temperatūrā 15 minūtes, pēc tam zemā temperatūrā (4 ° C) ledusskapī 18 ... 20 stundas un ūdens vannā 15 minūtes. Pēc tam pievieno hemolītisko sistēmu, sakrata, atkal ievieto ūdens vannā un reģistrē reakciju, tāpat kā RSC. Apstiprināta RDSC efektivitāte vairāku infekcijas slimību (tuberkulozes, vibriozes, brucelozes u.c.) diagnostikā.

Komplementa saistīšanās nomākšanas reakcija (RPSK) vai inhibīcijas reakcija, netiešā RSK.Šajā reakcijā ir iesaistīts vēl viens komponents - standarta imūnserums, kas satur antivielas pret antigēnu, ko parasti izmanto diagnostikai un tādējādi pozitīvi reaģē klasiskajā CSC.

Testa serumu sajauc ar antigēnu un kādu laiku tur bez komplementa. Tad pievieno komplementu un standarta serumu, mēģenes sakrata un ievieto ūdens vannā uz 20...30 minūtēm, pēc tam pievieno hemolītisko sistēmu un liek atpakaļ ūdens vannā. Ja hemolīzes nav, rezultāts ir negatīvs, jo testa serums nereaģēja ar antigēnu un pēdējais reaģēja ar standarta serums saistot papildinājumu. Ja testa serums ir no slima dzīvnieka, tas satur specifiskas antivielas attiecībā pret antigēnu, t.i., notiek reakcija starp antigēnu un antivielām bez komplementa saistīšanās. Antigēns, mijiedarbojoties ar testa seruma antivielām, nereaģē (tiek nomākts) ar standarta (acīmredzami zināmu specifisko) serumu, komplements paliek brīvs un reaģē hemolītiskajā sistēmā - notiek hemolīze, reakcijas rezultāts ir pozitīvs. attiecībā uz testa serumu.

Metode fluorescējošās antivielas (MFA).Šīs metodes iespējas ir saistītas ar seroloģisko reakciju pirmās fāzes specifiku ar augstu luminiscences analīzes jutīgumu. MFA īstenošanai ir nepieciešami ļoti specifiski imūni luminiscējoši serumi. Ir zināms, ka dažādos seroloģiskajos testos, ko izmanto mikrobioloģiskajā praksē, galvenokārt tiek iesaistīti trīs komponenti: baktēriju antigēns, antiviela un komplements. Visas trīs sastāvdaļas faktiski ir antigēni un imūnserumi, un attiecīgi pret katru no tiem var iegūt luminiscējošas antivielas. Atkarībā no tā, kāda veida luminiscējošais serums tiek izmantots (pret baktēriju antigēnu, antibakteriālām antivielām, komplementu), ir trīs galvenie fluorescējošo antivielu metodes varianti: tiešais (1) un netiešais (2) variants un netiešā varianta modifikācija, izmantojot komplementu. Imunoloģiskā reakcija starp antigēnu un antivielu šajās modifikācijās tiek veikta tieši uz stikla priekšmetstikliņa. Mikroorganismu fiksēšanai izmanto organiskos šķīdinātājus: acetonu, etanolu, metanolu, dioksānu, kā arī parastos mikrobioloģiskajā praksē izmantotos fiksatorus: formalīnu, Ņikiforova maisījumu, Karnoja šķidrumu u.c.

Tiešā iespēja. Gatavajam preparātam uz noteiktu laiku uzklāj specifisku luminiscējošu serumu, pēc tam lieko serumu notecina, preparātu nomazgā un aplūko fluorescējošā mikroskopā. Šo metodi izmanto baktēriju noteikšanai patoloģiskā materiālā, vides objektos, kā arī patogēnu identificēšanai kultūrās.

Netiešā (divpakāpju) iespēja. Pirmajā posmā notiek specifiska antigēna saistība ar atbilstošo nemarķēta seruma antivielu. Otrajā posmā specifiska nemarķēta antiviela saistās ar pretsugas luminiscējošu antivielu, kas atrodas tāda dzīvnieka serumā, kas imunizēts ar tās dzīvnieku sugas globulīniem (vai pilnu asins serumu), no kuras tika izmantots imūnserums.

Netiešs antikomplementārs (trīspakāpju) variants. Pirmais posms: antigēnu nemarķēta antivielu kompleksa veidošanās. Otrais solis: normāla seruma slāņošana, kas satur komplementu. Trešais posms: antigēna-antivielu-komplementa kompleksu apstrādā ar luminiscējošu anti-komplementāru serumu, kas sagatavots trušu imunizācijas laikā ar tās dzīvnieku sugas serumu, kas kalpoja par komplementa avotu.

Netiešos MFA variantus var izmantot gan antigēnu noteikšanai, gan antivielu noteikšanai. Turklāt, lai iestatītu divpakāpju variantu, jums ir nepieciešams ierobežots pretsugas luminiscējošu serumu komplekts (pret buļļa, aitas, zirga, cūkas u.c. globulīniem) un anti-komplementāram variantam, pietiek tikai ar vienu luminiscējošu serumu pret jūrascūciņu globulīniem.

Tehnika un imunoluminiscence un mikroskopija. Veterināro bakterioloģisko laboratoriju praksē tiek izmantoti biofabrikas ražošanas luminiscējošie serumi. Atkarībā no fluorohroma veida luminiscējošie serumi objektam nodrošina vai nu zaļu mirdzumu (krāsviela uz fluorescējošas bāzes), vai sarkanu (krāsviela uz rodamīna bāzes).

Lai veiktu imūnluminiscences mikroskopiju, testa materiāls jāuzliek uz attaukota, plāna, bez skrāpējumiem stikla priekšmetstikliņa. Dzīvnieku orgānu un audu pētījumos preparātus-nospiedumus sagatavo plānā kārtā. Preparātus žāvē gaisā un ievieto fiksējošā šķidrumā (etanols - 15 min, metanols - 5 min, acetons - 5 min). Ja nepieciešams, pēc nostiprināšanas preparātus kādu laiku var uzglabāt ledusskapī. Secība un turpmākās procedūras ir atkarīgas no izmantotā MFA veida (vienpakāpes, divpakāpju, trīspakāpju). Preparātu apstrādi ar luminiscējošiem serumiem, kā arī nemarķētiem pirmās pakāpes serumiem un komplementu veic 37 X mitrā kamerā (Petri trauciņos ar samitrinātu filtrpapīru).

Viena posma iespēja. Luminiscējošo serumu uzklāj uz stikla priekšmetstikliņa ar fiksētu testa materiālu (atšķaidījumā, kas norādīts uz ampulas). Zāles ievieto mitrā kamerā uz 15...20 minūtēm 37 "C. Pēc tam traukā mazgā ar buferētu fizioloģisko šķīdumu (pH 7,4), vairākas reizes mainot šķīdumu pēc 5...10 minūtēm vai zem. ieplūst krāna ūdens 3...5 minūtes Ūdenim jābūt neitrālam un bez dzelzs. Pēc tam preparātu (uz vienas glāzes var būt vairāki uztriepes) žāvē gaisā vai filtrpapīrā, pēc tam pilienu buferēta glicerīna ar Tiek uzklāts pH 8,0 un pārklāts ar segstikliņu. Uz pārklājuma uzklāj iegremdējamu nefluorescējošu šķidrumu un to mikroskopē.

Divu posmu iespēja. Uz stikla priekšmetstikliņa ar testa materiālu tiek uzklāts piliens imūnā nemarķēta pirmās pakāpes seruma. Zāles ievieto termostatā mitrā kamerā uz 15...20 minūtēm. Pēc tam to mazgā, kā aprakstīts iepriekš, žāvē un uzklāj pilienu luminiscējoša pretsugas seruma. Zāles atkal ievieto termostatā mitrā kamerā 15-20 minūtes. Atkārtojiet mazgāšanas procedūru un nosusiniet ar filtrpapīru. Uzklāj buferētu glicerīnu, pārklāj ar segstikliņu, uzklāj nefluorescējošu iegremdēšanas šķidrumu un mikroskopē.

Trīspakāpju variants (antikomplementārs). Uz stikla priekšmetstikliņa ar testa materiālu tiek uzklāts piliens imūnā nemarķēta pirmās pakāpes seruma. Zāles ievieto termostatā, kā aprakstīts iepriekš, žāvē un uz uztriepes uzklāj komplementa pilienu. Zāles atkal ievieto mitrā kamerā un termostatā uz 15...20 minūtēm, pēc tam tās nomazgā un uzklāj luminiscējošu antikomplementāru serumu. Turpmākās procedūras ir līdzīgas viena posma opcijai.

Kontroles preparātu sagatavošana un apstrāde. 1. Tiešajam variantam, lai noteiktu reakcijas specifiku starp antigēnu un luminiscējošu serumu, heterologu mikrobu sugu uztriepes preparāti jāapstrādā ar to pašu serumu. Šīm sugām jābūt antigēniski līdzīgām, bet pēc morfoloģijas atšķiras no pētītajiem mikroorganismiem; antigēnu attiecībā pret pētītajiem mikroorganismiem ir tālu, bet pēc morfoloģijas un izplatības ar tiem līdzīgs. Nospiedumu preparātus apstrādā ar luminiscējošu normālu serumu.

2. Netiešajam variantam ir nepieciešami trīs kontroles preparāti, kas apstrādāti ar normālu serumu, luminiscējošu pretsugu serumu bez imūnā nemarķēta seruma un luminiscējošu pretsugu serumu ar zināmu pirmās pakāpes imūnserumu.

3. Netiešajam variantam ar papildinājumu nepieciešami kontroles preparāti, kuru apstrādes laikā imūnserumu aizstāj ar parasto tāda paša tipa serumu un tādos pašos atšķaidījumos, kā arī preparātus, kas apstrādāti ar visām sastāvdaļām, izņemot imūnserumu.

Rezultātu izvērtēšana. Tiek ņemts vērā mirdzuma spilgtums, krāsa, lokalizācija un struktūra. Baktērijām, kas iekrāsotas ar luminiscējošu serumu, kas marķēts ar fluoresceīna izotiocianātu, perifērijā ir spilgti zaļš mirdzums apmales vai oreola veidā, centrālā daļa spīd vāji. Šāds spīdums tiek saukts par specifisku, atšķirībā no nespecifiskā, kad viss šūnas ķermenis spīd vienmērīgi. Jo izliektāka baktērijas šūna atrodas preparātā, jo asāka maliņa. Šo mirdzumu var izskaidrot ar to, ka uz novērotāja tīkleni no šūnas "perifēras" laukuma vienības tiek projicēts vairākas reizes vairāk antivielu nekā no mikrobu šūnas centrālās daļas. Jāpatur prātā, ka plastmasas šūnām (leptospira, vibrio) nav kontūras vai tā ir grūti pamanāma. Audu šķidrumā iegremdētās šūnās un jaunos Sibīrijas mēra baciļos kontūra parasti nav asi izteikta.

Luminiscences intensitāte tiek novērtēta pēc četru krustu sistēmas: + + + + - ļoti spilgta fluorescence gar mikrobu šūnas perifēriju, skaidri kontrastējot ar tumšo šūnas ķermeni; + + + - spilgta šūnas perifērijas fluorescence; + + - vājš šūnas perifērijas spīdums; + - mikrobu šūnu ķermeņa perifērijā nav kontrasta mirdzuma. Konkrēta mirdzuma neesamību norāda ar “-” (ir redzamas mikroorganismu ēnas). Diagnosticējot dažādus patogēnus, par pozitīvu rezultātu visbiežāk tiek uzskatīta specifiska baktēriju šūnu luminiscence ar vismaz četriem vai trim krustojumiem.

61. Papildināt reakcijas. Komplementa saistīšanās reakcija. Mehānisms, sastāvdaļas, iestatīšanas metodes, pielietojums. Radiālās hemolīzes reakcija

Reakcijas, kas ietver komplementu

Reakcijas, kas ietver komplementupamatojoties uz komplementa aktivāciju ar antigēna-antivielu kompleksu (komplementa fiksācijas reakcija, radiālā hemolīze utt.).

Komplementa fiksācijas reakcija (RSK) slēpjas faktā, ka, savstarpēji atbilstot, antigēni un antivielas veido imūnkompleksu, kuram caur Fc -antivielu fragments pievienojas komplementam (C), t.i., komplementa saistīšanās notiek ar antigēna-antivielu kompleksu. Ja antigēna-antivielu komplekss neveidojas, tad komplements paliek brīvs (13.8. att.). RSK tiek veikts divās fāzēs: 1. fāze - maisījuma, kas satur trīs antigēna + antivielas + komplementa sastāvdaļas, inkubācija; 2. fāze (indikators) - brīvā komplementa noteikšana maisījumā, pievienojot tam hemolītisko sistēmu, kas sastāv no aitu eritrocītiem un hemolītiskā seruma, kas satur antivielas pret tiem. Reakcijas 1.fāzē antigēna-antivielu kompleksa veidošanās laikā notiek komplementa saistīšanās, un tad 2.fāzē nenotiks ar antivielām sensibilizēto eritrocītu hemolīze; reakcija ir pozitīva. Ja antigēns un antiviela neatbilst viens otram (pārbaudāmajā paraugā nav antigēna vai antivielas), komplements paliek brīvs un 2.fāzē pievienosies eritrocītu-antieritrocītu antivielu kompleksam, izraisot hemolīzi; reakcija ir negatīva.

RSK izmanto, lai diagnosticētu daudzas infekcijas slimības, jo īpaši sifilisu (Wasserman reakcija).

Šo reakciju izmanto, lai noteiktu antivielas asins serumā pacientiem ar bakteriālām, vīrusu, vienšūņu infekcijām, kā arī identificētu un tipizētu no pacientiem izolētus vīrusus. RSK attiecas uz sarežģītām seroloģiskām reakcijām, kurās papildus antigēnam, antivielām un komplementam ir iesaistīta arī hemolītiskā sistēma, kas atklāj reakcijas rezultātus. RSK notiek divās fāzēs: pirmā ir antigēna mijiedarbība ar antivielu, piedaloties komplementam, un otrā ir komplementa saistīšanās pakāpes noteikšana, izmantojot hemolītisko sistēmu. Šī sistēma sastāv no aunu eritrocītiem un hemolītiskā seruma, kas iegūts, imunizējot laboratorijas dzīvniekus ar eritrocītiem. Eritrocīti tiek apstrādāti - sensibilizēti, pievienojot tiem serumu 37 ° C temperatūrā 30 minūtes. Sensibilizēto aunu eritrocītu līze notiek tikai pieķeršanās hemolītiskā komplementa sistēmai gadījumā. Ja tā nav, eritrocīti nemainās. RSK rezultāti ir atkarīgi no antivielu klātbūtnes testa serumā. Ja serumā ir antivielas, kas ir homologas reakcijā izmantotajam antigēnam, tad iegūtais antigēna-antivielu komplekss piesaistās, saista komplementu. Ja tiek pievienota hemolītiskā sistēma, šajā gadījumā hemolīze nenotiks, jo viss komplements tiek iztērēts antigēna-antivielu kompleksa specifiskajai saitei. Eritrocīti paliek nemainīgi, tāpēc hemolīzes neesamība mēģenē tiek reģistrēta kā pozitīvs RSK. Ja serumā nav antigēnam atbilstošu antivielu, specifiskais antigēna-antivielu komplekss neveidojas un komplements paliek brīvs. Kad tiek pievienota hemolītiskā sistēma, tai pievienojas komplements un izraisa eritrocītu hemodiazi. Sarkano asins šūnu iznīcināšana, to hemolīze raksturo negatīvu reakciju.

RSK ražošanai nepieciešams pacienta serums, komplements, hemolītiskā sistēma, kas sastāv no aitas eritrocītiem un hemolītiskā seruma, kā arī izotoniskais nātrija hlorīda šķīdums. Reakciju ievieto seroloģiskās mēģenēs. Aitu eritrocītus iegūst no defibrinētām aitas asinīm, trīs reizes mazgājot tās ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu. Hemolītisko serumu ražo gatavu ampulās, uz kuru etiķetes ir norādīts tā titrs, t.i., maksimālais seruma atšķaidījums, kas, pievienojot eritrocītiem komplementa klātbūtnē, tomēr izraisa hemolīzi. Hemolītisko serumu iegūst, imunizējot dzīvniekus, piemēram, trušus, ar aunu eritrocītiem. Iestatot reakciju, serumu izmanto trīskāršā titrā. Piemēram, hemolītiskā seruma titrs ir 1: 1200, un darba atšķaidījums ir 1: 400. Kā komplementu izmanto svaigu jūrascūciņu asins serumu (24-48 stundu laikā) vai sauso komplementu ampulās. Pirms RSK iestatīšanas komplementu atšķaida attiecībā 1:10 un titrē, lai noteiktu titru - mazāko komplementa daudzumu, kas nodrošina eritrocītu hemolīzi, ja to apvieno ar šajā reakcijā izmantoto hemolītisko sistēmu. Ņemot vērā antigēna iespējamās anti-komplementārās īpašības, veidojot reakciju, noteiktajam darba komplementa titram tiek ņemts vērā 20-30%.
CSC antigēns ir nogalinātu baktēriju suspensijas, no šīm suspensijām pagatavoti ekstrakti, atsevišķas mikrobu ķīmiskās frakcijas. Galvenā prasība pēc antigēna ir komplementa aktivitātes inhibīcijas trūkums. Tam nevajadzētu būt antikomplementārām īpašībām. Lai atklātu šīs antigēna īpašības, komplements tiek papildus titrēts reakcijā izmantotā antigēna klātbūtnē. Ir noteiktas shēmas RSC iestatīšanai. Reakcijas rezultāti tiek ņemti vērā, ņemot vērā eritrocītu hemolīzes esamību vai neesamību hemolītiskajā sistēmā. RSK izmanto sifilisa (Vasermana reakcija), gonorejas (Borde-Gangu reakcija), toksoplazmozes, riketsijas un vīrusu slimību diagnostikā.

Radiālās hemolīzes reakcija (RRH ) ievieto agara gela iedobēs, kas satur aunu eritrocītus un komplementu. Pēc hemolītiskā seruma (antivielas pret aitu eritrocītiem) pievienošanas gēla iedobēm ap tām veidojas hemolīzes zona (antivielu radiālās difūzijas rezultātā). Tādējādi ir iespējams noteikt komplementa un hemolītiskā seruma aktivitāti, kā arī antivielas asins serumā pacientiem ar gripu, masaliņām, ērču encefalītu. Lai to paveiktu, uz eritrocītiem tiek adsorbēti attiecīgie vīrusa antigēni, un gēla iedobēm, kurā ir šie eritrocīti, tiek pievienots pacienta asins serums. Pretvīrusu antivielas mijiedarbojas ar vīrusu antigēniem, kas adsorbēti uz eritrocītiem, pēc tam šim kompleksam pievieno komplementa sastāvdaļas, izraisot hemolīzi.