Microbiologia reacției de fixare a complementului. Reacția de legare a complementului. Testul de fixare a complementului (CFR) este un test serologic complex în două etape. Înființarea experimentului principal RSC Borde - Zhangu

(RSK) propus de J. Bordeși despre. Zhangu. Reacția include două faze (Fig. 10-18).

În faza I (specifică) reacția de fixare a complementului (CFR) Ag (sau AT) dorit reacţionează cu antiserul de diagnostic (sau Ag diagnosticum) şi complement. Complexul Ag-AT rezultat leagă complementul.

În faza II (indicator) reacția de fixare a complementului (CFR) determina prezența complementului liber prin introducerea în mediul de reacție a sistemului hemolitic - eritrocite de oaie și ser hemolitic care conține AT la acestea. Dacă Ag și AT nu corespund între ele și nu formează complexe imune, atunci fixarea complementului nu are loc. În aia. În acest caz, complementul liber interacționează cu componentele sistemului hemolitic, fixându-se pe complexul AT eritrocit-antieritrocit. Consecința acestui lucru - hemoliza celulelor indicator (fenomenul „sângelui lac”) - reacția este considerată negativă.

Dacă în faza I a reacției de fixare a complementului (RCC) AT și Ag corespund între ele, apoi complexele imune rezultate leagă complementul, nu se observă distrugerea eritrocitelor după introducerea sistemului hemolitic, iar reacția este considerată pozitivă. Principalele dezavantaje ale RSC: complexitatea (include 5 componente), labilitatea unor componente [trebuie preparate chiar înainte de reacție (complement) sau cu câteva zile înainte (eritrocite de oaie)] și posibile proprietăți anti-complementare în seruri și Ag. Cu toate acestea, CSC este utilizat în diagnosticul multor boli, de exemplu, în diagnosticul sifilisului (reacția Wassermann).

RSK se caracterizează prin sensibilitate și specificitate ridicate și este utilizat pentru:

1) diagnostic serologic boli infecțioase(R. Wasserman - cu sifilis, R. Borde-Zhangu - cu gonoree cronică etc.);

2) identificarea bacteriilor și a altor microbi.

RSC se referă la reacții serologice complexe în care, pe lângă AG și AT, există și un sistem hemolitic (r. hemolysis), care dezvăluie rezultatul reacției.

RSK se desfășoară în două etape cu participarea a două sisteme:

1) primul sistem - AG + AT + complement - determină legarea complementului dacă AT corespunde lui AG. În caz de discrepanță între AT și AG, complementul rămâne liber;

al doilea sistem (indicator) - ser hemolitic (hemolisine) + eritrocite - arată rezultatul reacției în primul sistem: în cazul unui rezultat pozitiv al reacției în primul sistem (formarea complexului AG + AT + complement) , hemoliza nu se va produce în cel de-al doilea sistem din cauza lipsei de complement (eritrocitele se instalează în fundul tubului). În cazul unui rezultat negativ în primul sistem, al doilea este însoțit de hemoliză, deoarece se formează un complex de eritrocite + hemolisine + complement (vezi Anexa 3, Figurile 7 și 8).

Componente de reacție:

1) ser de testare (inactivat anterior prin încălzire la 56 0 C timp de 30 de minute);

2) antigen (facut din suspensii de microbi uciși, lizate microbiene, antigene complete, haptene, extracte lipidice tisulare);

3) complement;

4) ser hemolitic;

5) 3% suspensie de eritrocite de oaie;

6) soluție salină;

7) ser de control.

Completa. Ca o completare a RSC, se folosește zer proaspăt și uscat. porcușor de Guineea, deoarece în sângele unui cobai, complementul este conținut în cel maiși este prezent în mod constant decât la alte animale. Înainte de a seta RSK, titrarea complementului trebuie efectuată în reacția de hemoliză (eritrocite de oaie, ser hemolitic, complement, soluție salină) și trebuie determinată doza de lucru.

Titrul de complement- cea mai mare diluție a complementului care determină liza completă a eritrocitelor în prezența serului hemolitic.

Doza de lucru de complement- cantitatea de complement, care este cu 25% mai mare decât liniuța.

Ser hemolitic se prepară prin imunizarea iepurilor cu o suspensie 50% de eritrocite de berbec. Serul rezultat este inactivat prin încălzire la 56 0 C. Se determină titrul şi doza de lucru.

Titrul seric- diluția maximă a serului care provoacă liza completă a eritrocitelor în prezența complementului. Ca doză de lucru, serul hemolitic este luat într-un titru triplu.

RSC Borde-Gangu

Reacția este pusă pentru a diagnostica gonoreea cronică pentru a detecta anticorpii împotriva gonococului.

În RSC sunt implicate 2 sisteme: sistemul principal este serul de testare, antigenul, complementul, iar sistemul auxiliar, indicator sau hemolitic este serul hemolitic și eritrocitele de oaie.

Dacă în primul sistem se formează un complex specific antigen + anticorp, atunci complementul este adsorbit (combinat cu acest complex) și hemoliza nu are loc în al doilea sistem.

Reacția necesită:

1. Ser de testare, care se obține din sângele prelevat prin puncția venei cubitale a pacientului. După coagularea sângelui, serul este aspirat într-un tub separat și inactivat timp de 30 de minute la 56 0 C într-o baie de apă.

2. Antigen - o suspensie de gonococi uciși.

3. Eritrocitele de oaie se obțin din sânge steril defibrinat. Se spală prin centrifugare de 3 ori cu porții noi de ser fiziologic. În reacție se folosește o suspensie de 3% de eritrocite.

4. Serul hemolitic se prepară în prealabil prin imunizarea iepurilor cu eritrocite de berbec. Serul este titrat înainte de utilizare.

5. Complement – ​​ser proaspăt de cobai. Sângele este aspirat din inima unui cobai cu o seringă, după coagulare, serul este separat. Înainte de experiment, doza de lucru de complement este titrată. Pentru a face acest lucru, luați diluția principală a complementului 1:10 și turnați-o în eprubete, de la 0,1 la 0,5, după care volumul din fiecare eprubetă este ajustat cu soluție salină la 1,5 ml.

În același timp, se prepară un sistem hemolitic - ser hemolitic diluat într-un titru triplu + 3% suspensie de eritrocite de berbec. Ambele ingrediente sunt în volume diferite și ținute în termostat timp de 30 de minute (sensibilizarea amestecului), după care amestecul se adaugă în 1 ml în eprubete și se pune într-un termostat timp de 30 de minute. 3 eprubete servesc drept control:

1. 1 ml sistem hemolitic + 1,5 ml ser fiziologic;

2. 0,5 ml complement 1:10 + 0,5 ml suspensie eritrocitară + 1,5 ml ser fiziologic.

Titrul de complement este cantitatea minimă la care mai are loc hemoliza. Pentru a determina reacția, se ia o doză de lucru de complement, crescută față de titru cu 20-25%, adică, de obicei, cantitatea de complement care se află în penultima eprubetă cu hemoliză. O creștere a dozei de complement este necesară deoarece în reacție, activitatea complementului poate fi oarecum suprimată de alte ingrediente ale reacției (antigen, ser).

Declarația experimentului principal RSC Borde - Zhangu.

La început, serul de testare inactivat și diluat 1:5 se toarnă în 2 eprubete. Apoi antigenul este turnat în prima eprubetă, în a doua soluție fiziologică. După aceea, în toate tuburile se adaugă o doză de lucru de complement.

După amestecarea ingredientelor, grătarul cu eprubete se pune într-un termostat la 37 0 C timp de 30 de minute (legare la cald). Cu legare la rece, suportul cu eprubete se pune intr-un ghetar la temperatura de -4 0 C timp de 18 ore. După păstrarea într-un termostat, se adaugă un sistem hemolitic în toate eprubetele. Reacția se pune într-un volum de 0,5 ml. Eprubetele se pun din nou într-un termostat timp de 2 ore, după care se efectuează o înregistrare preliminară a rezultatelor. Tuburile rămân temperatura camerei, iar a doua zi se notează rezultatul final.

Gradul de intensitate al reacției este estimat în plusuri. Întârzierea completă a hemolizei - patru plusuri (++++), incompletă - trei și un plus. Hemoliza completă este indicată prin semnele minus (-).

RSK Wasserman

Este folosit pentru a diagnostica sifilisul pentru a detecta anticorpi, precum și pentru a determina eficacitatea terapiei specifice. Se bazează pe principiul reacției de fixare a complementului Borde-Gangou. O diferență semnificativă în reacția Wassermann este nespecificitatea antigenului: extractele lipoide din organele normale ale animalelor sunt folosite ca antigene.

Pentru a stabili reacția Wasserman, este necesar să aveți serul pacientului, antigenele diagnostice cu reacție încrucișată nr. 1 și nr. 2, complement, ser hemolitic, eritrocite de berbec, ser fiziologic.

Diagnosticum Nr. 1 - specific, treponemic.

Diagnosticum No. 2 este un antigen nespecific, cardiolipin, care este un extract de inimă de bovine foarte purificat, cu o compoziție chimică constantă de lipoide. Lipoizi extrași din inimă compoziție chimică sunt apropiate de lipoizii treponema pallidum, prin urmare, deși nu sunt specifici, fixează anticorpi împotriva spirochetelor. Acești antigeni sunt produși central și utilizați în reacție, diluați conform titrului indicat pe etichetă.

Concomitent cu experimentul principal se plasează 2 martori: cu seruri evident negative și pozitive.

Testul de fixare a complementului (CFR) este un test serologic care este comparabil ca sensibilitate la metodele de precipitare, aglutinare și neutralizare. RSK este o metodă în care sunt utilizate două sisteme antigen-anticorp:

primul este specific;

al doilea este indicator (hemolitic).

Pentru RSC sunt necesare 5 componente: antigen de diagnostic, anticorpi de diagnostic, antigen indicator (eritrocite de oaie), anticorpi indicator (hemolizine de iepure), complement.

Interacțiunea specifică dintre antigen și anticorp este însoțită de fixarea complementului. Complexul rezultat nu se manifestă vizual. Sistemul hemolitic este folosit ca indicator. Serul hemolitic sensibilizează eritrocitele la acțiunea complementului, în prezența căruia are loc liza eritrocitelor (hemoloza). Dacă nu există hemoliză, atunci complementul este legat de primul sistem și, prin urmare, antigenul din acesta corespunde anticorpului - un răspuns pozitiv. Dacă anticorpul nu se potrivește cu antigenul, complexul nu se formează și complementul, rămânând liber, se combină cu cel de-al doilea sistem, provocând hemoliză - reacția este negativă.

Pentru a configura RSC, toate ingredientele de reacție sunt pregătite și titrate înainte de experimentul principal.

Serul (pacient sau diagnostic) în ajunul reacției este încălzit într-o baie de apă la o temperatură de 56ºС timp de 30 de minute pentru a-și inactiva propriul complement. Unele seruri, în special de la animale imunizate, au proprietăți anti-complement, de exemplu. capacitatea de a lega complementul în absența unui antigen omolog. Anticomplementaritatea este eliminată prin tratarea lor cu dioxid de carbon, încălzirea la o temperatură de 57-58ºС, congelarea unică la o temperatură de -20ºС sau -70ºС și îndepărtarea sedimentului prin centrifugare, adăugarea de ser complement într-un volum de ser 1:10 și încălzirea acestuia. dupa incubare la rece timp de 18- 20 ore.Pentru a preveni anticomplementaritatea serurilor se pastreaza in forma liofilizata sau congelate la temperaturi scazute.

Culturile de diferite microorganisme ucise, lizatele acestora, componentele bacteriilor, organele alterate patologic și normale, lipidele tisulare, virușii și materialele care conțin virusuri pot servi ca antigen pentru CSC. Mulți antigeni microbieni sunt produși industrial. Anticomplementaritatea antigenelor este eliminată prin metode precum termoliza (congelare și decongelare multiplă), tratarea cu solvenți grăsimi (eter, cloroform, acetonă), alcooli (metanol, etanol) etc.

Ca o completare, se utilizează ser de cobai luat imediat înaintea experimentului; poate fi folosit și complement uscat. Pentru a obține o soluție bazică pentru titrarea ulterioară, complementul este diluat 1:10 cu soluție izotonică de clorură de sodiu.

Eritrocitele de oaie se folosesc sub formă de 3 suspensii în soluție izotonică de clorură de sodiu. Sângele (100-150 ml) se ia din vena jugulară, așezat într-un borcan steril cu perle de sticlă, defibrinat prin agitare timp de 10-15 minute și filtrat prin 3-4 straturi de tifon steril pentru a elimina fibrina. Eritrocitele sunt spălate de 3 ori cu soluție izotonă de clorură de sodiu, adăugându-l la sedimentul eritrocitar la volumul sanguin inițial. Eritrocitele pot fi păstrate timp de 5-6 zile la 4-6ºС. Perioada de valabilitate a eritrocitelor crește atunci când sunt conservate cu formol.

Serul hemolitic pentru CSC se obține după cum urmează Iepurii sunt imunizați prin injectarea lor în vena urechii cu suspensie 50% de eritrocite de berbec spălate (1 ml de 4-6 ori la două zile). Proba de ser se obține la 7 zile după ultima injecție. Dacă titrul seric nu este mai mic de 1:1200, atunci sângerarea se face. Serul este încălzit timp de 30 de minute la o temperatură de 56ºС. Pentru a preveni creșterea bacteriilor, în serul hemolitic se adaugă un conservant (mertiolat 1:10.000 sau 1 acid boric).

Sistemul hemolitic este format din ser hemolitic amestecat în volume egale (luat într-un titru triplu) și 3 suspensii de eritrocite berbec. Pentru a sensibiliza eritrocitele cu hemolizine, amestecul este păstrat într-un termostat la o temperatură de 37ºС timp de 30 de minute.

Titrarea serului hemolitic. Serul este titrat prin combinarea a 0,5 ml din acesta (în diluții de 1:600, 1:1200, 1:1600, 1:3200 etc.) cu 0,5 ml din 3 suspensii eritrocitare și 0,5 ml de complement proaspăt în diluție 1:10 . Volumul amestecului pentru reacţia din eprubetele de control a fost ajustat la 1,5 ml prin adăugarea de soluţie izotonică de clorură de sodiu. Rezultatele reacției sunt luate în considerare după 1 oră de incubare la o temperatură de 37ºС. Titrul serului hemolitic este cea mai mare diluție a acestuia, determinând hemoliză completă. Serul se păstrează sub formă liofilizată.

Schema de titrare a serului hemolitic

Titrarea complementului.Înainte de experiment, soluția de bază de complement (1:10) se toarnă într-o serie de eprubete de la 0,05 până la 0,5 ml și se adaugă la fiecare soluție izotonică de clorură de sodiu, aducând volumul de lichid la 1,5 ml. Tuburile sunt plasate într-un termostat la o temperatură de 37ºC timp de 45 de minute, apoi se adaugă un sistem hemolitic și se păstrează într-un termostat timp de 30 de minute, după care se determină titrul de complement.

Pentru experiment se ia o doză de lucru de complement (conținută într-un volum de 0,5 ml), care este cu 20-30% mai mare decât titrul.

Schema de titrare a complementului

Termostat la 37ºС timp de 45 min

Termostat la 37ºС timp de 30 min

Titrarea antigenului. Antigenii utilizați pentru CSC pot adsorbi o anumită cantitate de complement, de ex. au proprietăți anticomplementare. Prin urmare, înainte de experiment, antigenele sunt titrate în prezența unei doze de lucru de complement. Într-o măsură mai mică, proprietățile anticomplementare sunt exprimate în antigeni specifici produși prin producție. Titrul lor este determinat nu înainte de fiecare experiment, ci o dată pe lună, ținând cont de posibilitatea scăderii acestuia în timpul depozitării.

Pentru a determina titrul antigenului, acesta se toarnă într-un număr de eprubete în cantitate descrescătoare de la 0,5 la 0,05 ml, aducând volumul din acestea la 1 ml prin adăugarea de soluție de clorură de sodiu. Apoi, se adaugă 0,5 ml din doza de lucru de complement în fiecare eprubetă și se plasează într-un termostat timp de 1 oră la o temperatură de 37ºС. După aceea, se adaugă 1 ml de sistem hemolitic în toate eprubetele, acestea sunt din nou incubate timp de 1 oră într-un termostat și se iau în considerare rezultatele reacției.

Titrul de antigen este considerat a fi cea mai mică cantitate la care are loc hemoliza completă. Pentru CSC, se utilizează o doză de lucru de antigen, care este de aproximativ 1/2-1/3 titr. Antigenele în prezența cărora titrul complementului scade cu mai mult de 30% sunt nepotriviți pentru reacție.

Schema de titrare a antigenului

Termostat la 37ºС timp de 1 oră

Termostat la 37ºС timp de 1 oră

Realizarea experienței principale a RSC. Volumul total al ingredientelor de reacție este de 2,5 ml, volumul dozei de lucru a fiecăruia dintre ele este de 0,5 ml. Ser în diluția corespunzătoare, antigenul și complementul sunt introduse în primul tub, serul în diluția corespunzătoare, complementul și soluția izotonică de clorură de sodiu (control seric) în al doilea tub, antigenul, complementul și soluția izotonă de clorură de sodiu (controlul antigenului) în al treilea tub. Totodată, se prepară un sistem hemolitic prin amestecarea a 2 ml de ser hemolitic într-un titru triplu (în raport cu cel specificat în instrucțiuni) și a 3% suspensie de eritrocite de oaie (în raport cu volumul sanguin inițial). Tuburile se țin într-un termostat la o temperatură de 37ºС timp de 1 oră, apoi se adaugă 1 ml de sistem hemolitic (al doilea sistem) la primele 3 tuburi (primul sistem). După amestecarea temeinică a ingredientelor, eprubetele sunt plasate din nou într-un termostat timp de 1 oră la o temperatură de 37ºС.

Schema de desfășurare a experimentului principal al RSC

Termostat la 37ºС timp de 1 oră

Termostat la 37ºС timp de 1 oră

Rezultatele reactiei se iau in considerare in prealabil - dupa scoaterea eprubetelor din termostat si in final - dupa ce au fost tinute 15-18 ore la frigider sau la temperatura camerei.

În numărarea finală, intensitatea reacției este exprimată în plus: (++++) - o reacție puternic pozitivă, caracterizată printr-o întârziere completă a hemolizei (lichidul din eprubetă este incolor, toate eritrocitele se instalează în fund). ); (+++, ++) - reacție pozitivă, care se manifestă prin creșterea culorii lichidului din cauza hemolizei și scăderea numărului de eritrocite din sediment; (+) - reacție slab pozitivă (lichidul este intens colorat, există o cantitate mică de eritrocite în fundul tubului). Cu o reacție negativă (-), se observă hemoliză completă, lichidul din eprubetă are o culoare roz intens (sânge lac).

Au fost propuse o serie de modificări RSC, care se caracterizează printr-o sensibilitate crescută și o cantitate mai mică de ingrediente utilizate. Deci, de exemplu, în studiile virologice, volumul de ingrediente pentru CSC la rece este de 1 ml. Pentru picurare RSC, luați 1 picătură de ser + 1 picătură de antigen + 1 picătură de complement + 2 picături de sistem hemolitic.

Reacția de legare a complimentului a găsit cea mai largă distribuție în diagnosticul microbiologic și serologic.

Cu ajutorul RSK, anticorpii de fixare a complementului sunt detectați în serul sanguin al pacienților cu sifilis, mucă, gonoree cronică, rickettsioză, boli virale etc.

RSC este de interes deosebit pentru imunologia clinică. Reacția este utilizată pentru a izola diferite subpopulații de limfocite, pentru a detecta antigene HLA de pe trombocite, limfoblaste transplantate, fibroblaste, celule tumorale și antigene specifice trombocitelor, precum și anticorpii corespunzători.

ÎN Reacția se bazează pe două fenomene - bacterioliză și hemoliză. Complementul este implicat în manifestarea lor. Prin urmare, în RSC sunt utilizate două sisteme de componente: 1) asigură fenomenul de bacterioliză și este utilizat în scopuri de diagnostic; 2) hemolitic, indicator, auxiliar; vă permite să stabiliți dacă complementul a legat sau nu legat în primul sistem (vezi schema de culori din Fig. I). Anterior, o suspensie de bacterii era folosită ca antigen, așa că primul sistem a fost numit bacteriolitic (în cazurile pozitive a avut loc liza bacteriană).

Stabilirea RSC se realizează în două etape. În prima etapă, se prepară un sistem bacteriolitic: 0,5 ml de ser de testat se amestecă cu antigenul în eprubete, se adaugă complement într-o doză (titru) strict definită. Amestecul de antigen - ser-complement (sistem bacteriolitic) se menține într-o baie de apă (sau termostat) timp de 20 ... 40 de minute la 37 ... 38 "C. Rezultatul interacțiunii componentelor din eprubetă. este invizibil, lichidul rămâne transparent și incolor Pentru a determina, contactat Dacă complementul se află în sistemul bacteriolitic, se realizează a doua etapă a reacției: componentele sistemului hemolitic se adaugă în eprubete - eritrocitele de oaie spălate și ser hemolitic inactivat, așa cum se arată în schemă.Toate componentele sistemului bacteriolitic sunt agitate pentru a se amesteca în eprubetă, plasate într-o baie de apă la 37... 38 "C timp de 20...40 min. Apoi se adaugă componentele sistemului gemologic, totul se agită a doua oară și se pune din nou într-o baie de apă timp de 10-15 minute.

Rezultat preliminar. Dacă serul este obținut de la un animal bolnav, atunci acesta conține anticorpi care se combină cu un antigen specific. Complementul se leagă de acest complex (antigen - anticorp) - nu are loc hemoliza, rezultatul este pozitiv.

Nu există anticorpi în serul unui animal sănătos: complexul antigen-anticorp nu se formează, complementul din sistemul bacteriologic nu se leagă. Când se adaugă eritrocite și hemolizină (acesta este un antigen și un anticorp între ele), complementul reacționează cu acest complex - va avea loc hemoliză, rezultatul este negativ (vezi culoarea Fig. II).

Raportul final al rezultatului. Tuburile se lasă la temperatura camerei timp de 15...20 ore.Dacă serul din sistemul bacteriolitic a fost de la un animal bolnav, în tub se formează un complex specific antigen-anticorp, care adsorb (leagă) tot complementul adăugat. În consecință, în a doua, hemolitică, de sistem, nu va avea loc hemoliză, eritrocitele se vor așeza pe fundul tubului, iar supernatantul este transparent. Rezultatul RSC este pozitiv.

Dacă nu există anticorpi specifici pentru antigenul utilizat în serul de testat (în cazurile în care serul este de la un animal sănătos), complexul antigen-anticorp nu se formează în sistemul bacteriolitic și, prin urmare, complementul din acest sistem nu este format. adsorbit, dar rămâne liber. Când se adaugă componentele sistemului hemolitic (în a doua fază a reacției), complementul interacționează cu al doilea complex (hemolizină-eritrocite), are loc hemoliza eritrocitelor - nu se formează precipitat, lichidul din eprubetă este roșu lac . Rezultatul RSK este negativ.

RSK. utilizați: 1) pentru a detecta anticorpi specifici în serul unui animal bolnav (în diagnosticul de bruceloză, peripneumonie, mucă, leptospiroză, tripanosomiază etc.); 2) pentru a detecta un antigen specific (bacterian sau viral) în materialul de testat în prezența unui ser imun specific.

Pentru a configura RSK, trebuie să aveți: probe de ser primite pentru cercetare; două seruri, cunoscute pozitive (standard, care oferă un rezultat pozitiv) și două seruri normale. Toate serurile într-o diluție 1:10 sunt inactivate la 56...58 °C timp de 30 de minute; antigen în diluție conform titrului; complementul diluat în conformitate cu titrul stabilit în timpul titrarii într-un sistem bacteriolitic; hemolizină în titrul de lucru; eritrocite de berbec (I: 40); ser fiziologic, pipete gradate, eprubete, suporturi, baie de apă la 37...38 °C.

Înainte de instalarea RSC, sângele de oaie este defibrinat, eritrocitele sunt spălate cu soluție salină prin centrifugare până când supernatantul este complet transparent, care este îndepărtat prin aspirație, iar eritrocitele precipitate sunt diluate în soluție salină 1:40 (2,5%). Antigenul este diluat conform titrului indicat pe etichetă de către biofabrica. Hemolizina și complementul sunt titrate înainte de setarea RSK.

Antigenul pentru CSC este preparat la biofabrici. De obicei, acestea sunt extracte din suspensii microbiene distruse (sau țesuturi care conțin virusuri). Antigenele nu trebuie să aibă un efect hemolitic, care este controlat în timpul reacției (într-o eprubetă se toarnă 1 ... 2 doze de antigen și 0,5 ml suspensie de eritrocite: nu trebuie să existe hemoliză). Pe fiola cu antigen, biofabrica indică faptul că este destinată RSK (sapny, bruceloză sau altele). Cutia de ambalare indică numărul de lot, data de fabricație, data de expirare, activitatea antigenului, adică în ce diluție ar trebui utilizat la setarea RSK (1:100, 1:150 etc.). În unele boli, alte materiale servesc drept antigene; de exemplu, pentru diagnosticul de peripneumonie la bovine, antigenul pentru CSC este limfa unui vițel infectat experimental subcutanat sau intrapleural. Cu depozitarea pe termen lung a antigenelor, titrul acestora este din nou verificat în laborator conform unei scheme speciale de titrare.

Serurile de testare primite pentru studiu sunt diluate cu soluție salină 1: 5 sau 1: 10, inactivate prin încălzire într-o baie de apă pentru a-și distruge propriul complement timp de 30 de minute la 56 ... 58 "C (ser de măgari, catâri, barde). - la 61 ° C).

Hemolizina se prepară în biofabrici prin hiperimunizarea iepurilor cu eritrocite de berbec spălate. Pentru aceasta, iepurilor li se injectează intravenos de 4...5 ori la intervale de 2...3 zile cu o suspensie de eritrocite 40...50%. La o săptămână după ultima injecție, se prelevează sânge de la iepuri, serul este aspirat steril, inactivat, conservat cu glicerol 1:1 sau 0,5% fenol, titrat, turnat în fiole. În laboratoare, înainte de setarea RSK, acestea sunt titrate din nou.

Schema de titrare a hemolizinei. Se prepară: i) Diluție de complement 1:20; 2) hemolizină 1:100 (0,2 ml hemolizină + 9,8 ml ser fiziologic); 3) suspensie de eritrocite de oaie 1:40; 4) soluție fiziologică de NaCl.

Pentru a configura reacția de titrare, două rânduri de eprubete sunt plasate într-un suport - unul auxiliar numai pentru prepararea diluțiilor de hemolizină, al doilea - pentru titrarea în sine. Diluția inițială a hemolizinei 1: 100 este adăugată la primul tub din fiecare rând, apoi se face o diluție în serie. Toate tuburile sunt agitate și plasate într-o baie de apă la 37...38°C timp de 10...15 minute. Luarea în considerare a rezultatului: în acest exemplu, cea mai mică cantitate (sau cea mai mare diluție) care a dat hemoliză completă este 1: 2000, adică acesta este titrul său real. Titrul de lucru este de 2 ori mai concentrat - 1:1000.

0,5 ml (indicat prin săgeți) din fiecare diluție din eprubetele de pe primul rând sunt transferate în eprubete separate de pe al doilea rând. Adăugați 0,5 ml de complement (1: 20), 0,5 ml de eritrocite de berbec (suspensie 2,5%, sau 1: 40) și 1 ml de soluție salină în toate tuburile din al doilea rând, astfel încât volumul de lichid din fiecare flacon să fie de 2,5 ml.

Notă. Pe baza faptului că la setarea finală a RSC vor participa 5 componente a câte 0,5 ml fiecare, care va alcătui un volum de 2,5 ml, acest volum este observat pe tot parcursul lucrării.

Tuburile se agită și se pun într-o baie de apă timp de 10-15 minute. Hemoliza va avea loc în primul rând în eprubete cu un conținut ridicat de hemolizină (cea mai mică diluție a acesteia este 1: 500, 1: 1000 ...). Cea mai mică cantitate de hemolizină (cea mai mare diluție a acesteia), care a provocat hemoliza completă a eritrocitelor în aceste condiții, se numește titru limitativ (real). hemolizină. Pentru lucrări ulterioare, hemolizina este utilizată de 2 ori mai concentrat, adică într-o cantitate dublă, un titru dublu, care se numește titlu de lucru. De exemplu, dacă titrul real este I:2500 (sau 1:2000), atunci titrul de lucru corespunde unei diluții de 1:1250 (sau 1:W00).

Complementul este o parte integrantă a serului proaspăt, limfei, fluidelor tisulare tipuri diferite animale (și oameni); descoperit de Buchner (1889). La insecte, complementul este absent. Complementul este o substanță de natură proteică, de structură complexă, rapid inactivată prin încălzire, depozitare prelungită, expunere la radiații ultraviolete, agitare puternică, filtrare prin filtre ceramice, adaos de caolin, acizi, alcalii, alcool, acetonă, cloroform, distilat. apa, suspensie de bacterii etc. Complementul se poate conserva prin adaugarea a 5 g sulfat de sodiu, 4 g acid boric la 100 ml ser de cobai. Activitatea complementară se menține până la șase luni. Cel mai bun mod conservare - uscare sub vid la temperatura joasa (liofilizare). În fiole sigilate în această stare, se păstrează timp de doi ani. Înainte de fiecare producție de RSK, activitatea complementului este verificată prin titrare, adică se determină titrul acestuia - cantitatea optimă necesară pentru această reacție. Complementul este titrat de două ori: în sisteme hemolitice și bacteriolitice.

Pentru titrarea complementului în sistemul hemolitic se prepară componente: complement la o diluție de 1: 20 (1 ml complement + 19 ml ser fiziologic); hemolizină, diluată în funcție de titrul de lucru; o suspensie de eritrocite de oaie spălate (1: 40), ser fiziologic. Eprubetele se pun într-un trepied și se toarnă în ele diferite cantități de complement cu o pipetă gradată cu un interval de 0,03 ml (0,13; 0,16; 0,19; 0,22 ..: până la 0,43 ml). Apoi adăugați componentele rămase (Fig. 57). Toate eprubetele se agită și se pun într-o baie de apă la 37...38 "C timp de 10...15 minute și se înregistrează rezultatul.

Luarea în considerare a rezultatului: cea mai mică cantitate de complement care a furnizat hemoliză completă (în acest exemplu, 0,25 ml) este luată ca titrul de complement.

Rezultatul titrarii este luat in considerare in tuburile cu cel mai mare continut de complement, unde se asteapta in primul rand hemoliza. Se numește cea mai mică cantitate de complement care asigură hemoliza completă a eritrocitelor în aceste condiții titrul complementului în sistemul hemolitic.

Pentru titrarea complementului în sistemul bacteriolitic este necesar să existe toate componentele reacției: complement (1:20), eritrocite (1:40), hemolizină în titrul de lucru, două seruri pozitive și două normale, un antigen specific. Serurile se diluează cu ser fiziologic 1:10, se inactivează timp de 30 de minute la 56...58 X. Fiecare ser se toarnă în două rânduri de eprubete de 0,5 ml. Complementul se adauga in cantitati tot mai mari in tuburile fiecarui rand, ca la titrarea intr-un sistem hemolitic; se începe cu cantitatea luată ca titru în sistemul hemolitic, apoi în fiecare eprubetă ulterioară se mărește doza cu 0,03 ml, nivelându-se volumul la 0,5 ml cu ser fiziologic.

După aceea, se adaugă 0,5 ml de antigen într-un rând de eprubete cu ser pozitiv și normal și se adaugă 0,5 ml de ser fiziologic în al doilea rând al fiecărui ser. Toate eprubetele sunt agitate și puse într-o baie de apă timp de 30-40 de minute. Apoi, în toate eprubetele se adaugă 0,5 ml hemolizină și 0,5 ml eritrocite, se agită și se pun într-o baie de apă timp de 10-15 minute. Cea mai mică cantitate de complement care a asigurat liza completă a eritrocitelor în ambele rânduri de tuburi (cu antigen și fără antigen) a două seruri normale, într-un rând (fără antigen) din fiecare ser pozitiv și cu o întârziere completă (absență) a hemolizei în rândurile de seruri pozitive cu antigen (în aceleași doze de complement), se numesc titrul complementului, care este utilizat în formularea experienței principale a RSC în studii de diagnostic.

Experiența principală a RSC (studiul de diagnostic propriu-zis). Două rânduri de eprubete sunt plasate în rafturi în funcție de numărul de probe de ser studiate. Se toarnă 0,5 ml din fiecare ser inactivat în două eprubete: la una se adaugă antigen - 0,5 ml, la cealaltă se adaugă 0,5 ml soluție salină (fără antigen), iar prin adăugarea complementului, ele alcătuiesc sistemul bacterinolitic și apoi se adaugă hemolitic.

Componente necesare: 1) ser test, inactivat, diluat cu ser fiziologic 1:10; 2) un antigen specific diluat conform titrului indicat de biofabrica pe eticheta ambalajului; 3) complement în titrul stabilit; 4) hemolizină în titru de lucru; 5) o suspensie de eritrocite de oaie spălate 1: 40; 6) soluție salină de NaCl. Serurile de testare se toarnă în două rânduri de eprubete. Pentru orice număr de seruri testate, se utilizează ca martori seruri pozitive cunoscute (care dă un rezultat pozitiv) și normale (de la un animal sănătos, care dă un rezultat negativ).

Tuburile cu componentele sistemului bacteriolitic se agită, se pun într-o baie de apă timp de 20...40 min la 37...38°C. Tuburile sistemului bacteriolitic din al doilea rând fără antigen se agită, se pun într-o baie de apă în aceleași condiții.

Apoi, componentele sistemului hemolitic sunt adăugate în toate eprubetele de pe primul și al doilea rând și puse într-o baie de apă pentru a doua oară timp de 10...15 minute. În toate tuburile din al doilea rând fără antigen are loc hemoliză completă.

Până la obținerea rezultatului final, tuburile se lasă la temperatura camerei timp de 18 ... .

Indicațiile reacției în eprubete cu ser de testare sunt considerate fiabile dacă nu există hemoliză în eprubete cu ser și antigen pozitiv, cu hemoliza completă în eprubete cu ser pozitiv fără antigen și în toate eprubetele cu ser normal cunoscut (Fig. 61).

Această reacție ar trebui să fie însoțită de controale ale antigenului, complementului, hemolizinei, eritrocitelor. Pentru a face acest lucru, antigenul cu eritrocite de oaie este turnat în eprubete separate; complement cu eritrocite fără hemolizină; hemolizină cu eritrocite fără complement; eritrocite și soluție salină. Volumul din fiecare tub este ajustat cu soluție salină la 2,5 ml. Tuburile sunt agitate și plasate într-o baie de apă la 37°C timp de 20 de minute. Toate tuburile de control trebuie să fie lipsite de hemoliză.

Rezultatul RSC exprimate de obicei prin cruci. Indicatori ai unui rezultat pozitiv al reacției: + + + + (///) - sedimentare completă a eritrocitelor (fără hemoliză), lichidul de deasupra sedimentului este incolor, + + + (///) - lichidul de deasupra sedimentului este abia perceptibil colorat gălbui. Rezultatul îndoielnic al reacției: prezența eritrocitelor așezate la fund și colorarea parțială a fluidului supernatant din cauza lizei unei părți a eritrocitelor este notă cu + + - (++), adică două și două și un jumătăţi de cruci. O hemoliză pronunțată (fără sediment) sau cu un sediment mic (+) este un rezultat negativ.

Reacția de fixare a complementului pe termen lung (RDSC). Mai eficient în sensibilitate, spre deosebire de RSC clasică obișnuită. Esența reacției este că sistemul bacteriolitic este menținut la trei diferite conditii de temperatura: după amestecarea componentelor la temperatura camerei timp de 15 minute, apoi la temperatură scăzută (4 ° C) la frigider timp de 18 ... 20 de ore și în baie de apă timp de 15 minute. După aceea, se adaugă sistemul hemolitic, se agită, se pune din nou într-o baie de apă și se înregistrează reacția, ca în RSC. Eficacitatea RDSC în diagnosticul unui număr de boli infecțioase (tuberculoză, vibrioză, bruceloză etc.) a fost confirmată.

Reacția de suprimare a legării complementului (RPSK) sau reacția de inhibare, RSK indirectă. O altă componentă este implicată în această reacție - un ser imun standard care conține anticorpi la un antigen utilizat de obicei pentru diagnosticare și, prin urmare, reacționând pozitiv în CSC clasic.

Serul de testat se amestecă cu antigenul și se păstrează un timp fără complement. Apoi se adaugă complement și ser standard, tuburile se agită și se pun într-o baie de apă timp de 20...30 de minute, după care se adaugă sistemul hemolitic și se pun din nou în baia de apă. Dacă nu există hemoliză, rezultatul este negativ, deoarece serul de testat nu a reacţionat cu antigenul, iar acesta din urmă a reacţionat cu ser standard prin legarea complementului. Dacă serul de testat este de la un animal bolnav, acesta conține anticorpi specifici în relație cu antigenul, adică are loc o reacție între antigen și anticorpi fără legarea complementului. Antigenul, interacționând cu anticorpii serului testat, nu reacționează (este suprimat) cu serul standard (specific evident cunoscut), complementul rămâne liber și reacționează în sistemul hemolitic - are loc hemoliza, rezultatul reacției este pozitiv în raport cu serul de testare.

Metodă anticorpi fluorescenți (MFA). Posibilitățile acestei metode se datorează specificității primei faze a reacțiilor serologice cu sensibilitate ridicată a analizei luminiscente. Pentru implementarea MFA, este necesar să existe seruri luminiscente imune foarte specifice. Se știe că în diverse teste serologice utilizate în practica microbiologică sunt implicate în principal trei componente: antigenul bacterian, anticorpul și complementul. Toate cele trei componente sunt, de fapt, antigene și seruri imune și, în consecință, anticorpi luminescenți pot fi obținuți împotriva fiecăruia dintre ei. În funcție de tipul de ser luminiscent utilizat (împotriva antigenului bacterian, anticorpilor antibacterieni, complement), se disting trei variante principale ale metodei anticorpilor fluorescenți: variante directe (1) și indirecte (2) și modificarea variantei indirecte folosind complement. Reacția imunologică dintre antigen și anticorp este efectuată în aceste modificări direct pe o lamă de sticlă. Pentru fixarea microorganismelor se folosesc solvenți organici: acetonă, etanol, metanol, dioxan, precum și fixatori convenționali folosiți în practica microbiologică: formol, amestecul lui Nikiforov, lichidul lui Carnoy etc.

Opțiune directă. Un anumit ser luminiscent este aplicat preparatului finit pentru un anumit timp, apoi excesul de ser este drenat, preparatul este spălat și vizualizat la microscop fluorescent. Această metodă este utilizată pentru detectarea bacteriilor în material patologic, obiecte de mediu, precum și pentru identificarea agenților patogeni în culturi.

Opțiune indirectă (în două etape). În prima etapă, are loc o conexiune specifică a antigenului cu anticorpul corespunzător al serului nemarcat. În a doua etapă, un anticorp specific nemarcat se leagă de un anticorp luminescent anti-specie conținut în serul unui animal imunizat cu globuline (sau ser de sânge integral) din specia animală de la care a fost utilizat serul imun.

Varianta indirectă anticolementară (în trei pași). Prima etapă: formarea unui complex de anticorpi antigen nemarcat. A doua etapă: stratificarea serului normal care conține complement. A treia etapă: complexul antigen-anticorp-complement este tratat cu ser anti-complement luminescent preparat în timpul imunizării iepurilor cu serul speciei animale care a servit ca sursă de complement.

Variantele indirecte de MFA pot fi utilizate atât pentru detectarea antigenului, cât și pentru detectarea anticorpilor. În plus, pentru a configura o variantă în două etape, trebuie să aveți un set limitat de seruri luminescente antispecie (împotriva globulinelor de taur, oaie, cal, porc etc.), iar pentru o variantă anti-complementară, este suficient sa ai un singur ser luminescent impotriva globulinelor de cobai.

Tehnica si imunoluminiscenta si microscopie. În practica laboratoarelor bacteriologice veterinare se folosesc seruri luminescente de producție biofabrică. În funcție de tipul de fluorocrom, serurile luminescente oferă fie o strălucire verde a obiectului (un colorant pe bază de fluorescent), fie una roșie (un colorant pe bază de rodamină).

Pentru a efectua microscopia cu imunoluminiscență, materialul de testat trebuie aplicat pe o lamă de sticlă degresată, subțire, fără zgârieturi. În studiul organelor și țesuturilor animalelor, preparatele-amprente sunt pregătite într-un strat subțire. Preparatele se usucă la aer și se pun într-un lichid de fixare (etanol - 15 min, metanol - 5 min, acetonă - 5 min). La nevoie, dupa fixare, preparatele se pot pastra ceva timp la frigider. Secvența și procedurile ulterioare depind de tipul de MFA utilizat (în o singură etapă, în două etape, în trei etape). Tratamentul preparatelor cu seruri luminescente, precum și cu seruri de primă etapă neetichetate și complement, se efectuează la 37 X într-o cameră umedă (cube Petri cu hârtie de filtru umezită).

Opțiune cu o singură etapă. Se aplică un ser luminiscent pe o lamă de sticlă cu material de testat fix (în diluția indicată pe fiolă). Medicamentul se pune într-o cameră umedă timp de 15...20 minute la 37 "C. Apoi se spală cu soluție salină tamponată (pH 7,4) într-un vas, schimbând soluția după 5...10 minute de mai multe ori, sau sub curgerea apei de la robinet timp de 3...5 minute Apa trebuie să fie neutră și lipsită de fier. Apoi preparatul (pot fi mai multe pete pe un pahar) este uscat în aer sau hârtie de filtru, după care o picătură de glicerol tamponat cu un Se aplică un pH de 8,0 și se acoperă cu o lamă. Se aplică un lichid nefluorescent de imersie pe lamelă și se microscopează.

Opțiune în două etape. O picătură de ser imun nemarcat din prima etapă este aplicată pe o lamă de sticlă cu materialul de testat. Medicamentul este plasat într-un termostat într-o cameră umedă timp de 15...20 de minute. Apoi se spală așa cum este descris mai sus, se usucă și se aplică o picătură de ser anti-specie luminiscent. Medicamentul este plasat din nou într-un termostat într-o cameră umedă timp de 15-20 de minute. Repetați procedura de spălare și uscați cu hârtie de filtru. Se aplică glicerol tamponat, se acoperă cu o lamă, se aplică un lichid de imersie nefluorescent și se microscopează.

Varianta în trei etape (anti-complementare). O picătură de ser imun nemarcat din prima etapă este aplicată pe o lamă de sticlă cu materialul de testat. Medicamentul este plasat într-un termostat, așa cum este descris mai sus, uscat și o picătură de complement este aplicată pe frotiu. Medicamentul se pune din nou într-o cameră umedă și într-un termostat timp de 15...20 de minute, după care se spală și se aplică ser anticomplementar luminiscent. Procedurile ulterioare sunt similare cu opțiunea într-o etapă.

Pregatirea si prelucrarea preparatelor de control. 1. Pentru varianta directă, pentru a determina specificitatea reacției dintre antigenul cu ser luminiscent, preparatele de frotiu din specii microbiene heterologe trebuie tratate cu același ser. Aceste specii ar trebui să fie asemănătoare antigenic, dar să difere ca morfologie de microorganismele studiate; îndepărtate în relație antigenică cu microorganismele studiate, dar asemănătoare ca morfologie și distribuție cu acestea. Preparatele de amprentă sunt tratate cu ser normal luminiscent.

2. Pentru varianta indirectă este necesar să existe trei preparate martor tratate cu ser normal, ser antispecie luminescent fără ser imun nemarcat și ser antispecie luminescent cu ser imunitar cunoscut din prima etapă.

3. Pentru optiunea indirecta cu complement sunt necesare preparate de control, în timpul procesării cărora serul imunitar este înlocuit cu ser normal de același tip și în aceleași diluții, precum și preparatele tratate cu toate ingredientele cu excepția serului imun.

Evaluarea rezultatelor. Se iau în considerare luminozitatea, culoarea, localizarea și structura strălucirii. Bacteriile colorate cu ser luminiscent marcat cu izotiocianat de fluoresceină au o strălucire verde strălucitoare în jurul periferiei sub formă de margine sau halou, partea centrală strălucește slab. O astfel de strălucire se numește specifică, spre deosebire de nespecifică, atunci când întregul corp celular strălucește uniform. Cu cât celula bacteriană se află mai convexă în preparat, cu atât marginea este mai ascuțită. Această strălucire poate fi explicată prin faptul că de câteva ori mai mulți anticorpi sunt proiectați pe retina observatorului dintr-o zonă unitară a „periferiei” celulei decât din partea centrală a celulei microbilor. Trebuie avut în vedere faptul că celulele plastice (leptospira, vibrioni) nu au un contur sau se observă cu greu. În celulele scufundate în lichid tisular și în bacili tineri antrax, conturul nu este de obicei exprimat brusc.

Intensitatea luminiscenței este evaluată conform sistemului cu patru cruci: + + + + - fluorescență foarte strălucitoare de-a lungul periferiei celulei microbiene, în contrast clar cu corpul întunecat al celulei; + + + - fluorescență strălucitoare a periferiei celulei; + + - strălucire slabă a periferiei celulei; + - fără strălucire de contrast a periferiei corpului celular microbian. Absența unei străluciri specifice este indicată de „-” (umbrele microorganismelor sunt vizibile). La diagnosticarea diferiților agenți patogeni, un rezultat pozitiv este cel mai adesea considerat o strălucire specifică a celulelor bacteriene nu mai puțin de patru sau trei încrucișări.

61. Reacții de completare. Reacția de legare a complementului. Mecanism, componente, metode de setare, aplicare. Reacție de hemoliză radială

Reacții care implică complement

Reacții care implică complementbazat pe activarea complementului de către un complex antigen-anticorp (reacție de fixare a complementului, hemoliză radială etc.).

Reacția de fixare a complementului (RSK) constă în faptul că, atunci când corespund între ele, antigenele și anticorpii formează un complex imun, la care, prin Fc -fragmentul de anticorpi unește complementul (C), adică legarea complementului are loc cu un complex antigen-anticorp. Dacă nu se formează complexul antigen-anticorp, atunci complementul rămâne liber (Fig. 13.8). RSK se efectuează în două faze: prima fază - incubarea unui amestec care conține trei componente ale antigenului + anticorpi + complement; Faza a 2-a (indicator) - detectarea complementului liber în amestec prin adăugarea la acesta a unui sistem hemolitic format din eritrocite berbec și ser hemolitic care conține anticorpi împotriva acestora. În prima fază a reacției, în timpul formării complexului antigen-anticorp, are loc legarea complementului, iar apoi în a 2-a fază nu va avea loc hemoliza eritrocitelor sensibilizate de anticorpi; reactia este pozitiva. Dacă antigenul și anticorpul nu corespund între ele (nu există antigen sau anticorp în proba de testat), complementul rămâne liber și în a 2-a fază se va alătura complexului eritrocit-anticorp antieritrocitar, determinând hemoliză; reactia este negativa.

RSK este utilizat pentru a diagnostica multe boli infecțioase, în special sifilisul (reacția Wasserman).

Această reacție este utilizată pentru a detecta anticorpi în serul sanguin al pacienților cu infecții bacteriene, virale, protozoare, precum și pentru a identifica și tipa virusuri izolate de la pacienți. RSK se referă la reacții serologice complexe în care, pe lângă antigen, anticorp și complement, este implicat și sistemul hemolitic, care dezvăluie rezultatele reacției. RSK se desfășoară în două faze: prima este interacțiunea antigenului cu anticorpul cu participarea complementului, iar a doua este identificarea gradului de legare a complementului folosind sistemul hemolitic. Acest sistem este format din eritrocite de berbec și ser hemolitic obținut prin imunizarea animalelor de laborator cu eritrocite. Eritrocitele sunt tratate - sensibilizate prin adăugarea de ser la ele la o temperatură de 37 ° C timp de 30 de minute. Liza eritrocitelor de berbec sensibilizate are loc numai în cazul atașării la sistemul complement hemolitic. În absența sa, eritrocitele nu se modifică. Rezultatele RSK depind de prezența anticorpilor în serul de testat. Dacă serul conține anticorpi omologi cu antigenul utilizat în reacție, atunci complexul antigen-anticorp rezultat se atașează, leagă complementul. Când se adaugă un sistem hemolitic, în acest caz, hemoliza nu va avea loc, deoarece întregul complement este cheltuit pe legătura specifică a complexului antigen-anticorp. Eritrocitele rămân neschimbate, astfel încât absența hemolizei în eprubetă este înregistrată ca RSK pozitiv. În absența anticorpilor corespunzători antigenului din ser, complexul specific antigen-anticorp nu se formează și complementul rămâne liber. Când se adaugă un sistem hemolitic, complementul se atașează de acesta și induce hemodiaza eritrocitară. Distrugerea globulelor roșii, hemoliza lor caracterizează o reacție negativă.

Pentru stadializarea RSK, aveți nevoie de: serul pacientului, complement, sistem hemolitic, format din eritrocite de oaie și ser hemolitic, precum și soluție izotonică de clorură de sodiu. Reacția se pune în eprubete serologice. Eritrocitele de oaie se obțin din sânge de oaie defibrinat prin spălarea lor de trei ori cu soluție izotonică de clorură de sodiu. Serul hemolitic este produs gata preparat în fiole, pe eticheta cărora este indicat titrul său, adică diluția maximă a serului, care încă provoacă hemoliză atunci când este adăugat la eritrocite în prezența complementului. Serul hemolitic se obține prin imunizarea animalelor, precum iepurii, cu eritrocite de berbec. La stabilirea reacției, serul este utilizat într-un titru triplu. De exemplu, titrul serului hemolitic este de 1: 1200, iar diluția de lucru este de 1: 400. Se folosește ser proaspăt de cobai (în 24-48 de ore) sau complement uscat în fiole. Înainte de setarea RSK, complementul este diluat 1: 10 și titrat pentru a stabili titrul - cea mai mică cantitate de complement care dă hemoliza eritrocitară atunci când este combinată cu sistemul hemolitic utilizat în această reacție. Având în vedere posibilele proprietăți anti-complementare ale antigenului, la stabilirea reacției, se acordă o alocație de 20-30% la titrul de complement de lucru stabilit.
Antigenul pentru CSC sunt suspensii de bacterii ucise, extracte preparate din aceste suspensii, fracțiuni chimice individuale ale microbilor. Principala cerință pentru antigen este absența inhibării activității complementului. Nu ar trebui să aibă proprietăți anticomplementare. Pentru a dezvălui aceste proprietăți ale antigenului, complementul este titrat suplimentar în prezența antigenului utilizat în reacție. Există anumite scheme pentru setarea RSC. Rezultatele reacției sunt luate în considerare de prezența sau absența hemolizei eritrocitelor în sistemul hemolitic. RSK este utilizat în diagnosticul de sifilis (reacție Wassermann), gonoree (reacție Borde-Gangu), toxoplasmoză, boli rickettsiale și virale.

Reacția de hemoliză radială (RRH ) plasate în godeuri de gel de agar care conțin eritrocite de berbec și complement. După adăugarea serului hemolitic (anticorpi împotriva eritrocitelor de berbec) în godeurile gelului, în jurul lor se formează o zonă de hemoliză (ca urmare a difuziei radiale a anticorpilor). Astfel, este posibil să se determine activitatea complementului și a serului hemolitic, precum și a anticorpilor din serul sanguin al pacienților cu gripă, rubeolă, encefalită transmisă de căpușe. Pentru a face acest lucru, antigenele corespunzătoare ale virusului sunt adsorbite pe eritrocite, iar serul de sânge al pacientului este adăugat în godeurile gelului care conține aceste eritrocite. Anticorpii antivirali interacționează cu antigenele virale adsorbite pe eritrocite, după care componentele complementului sunt atașate acestui complex, provocând hemoliză.