Микробиология на реакцията на свързване на комплемента. Реакция на свързване на комплемента. Тестът за фиксиране на комплемента (CFR) е сложен двуетапен серологичен тест. Създаване на основния експеримент RSC Borde - Zhangu

(RSK), предложено от Дж. Бордеи около. Джангу. Реакцията включва две фази (фиг. 10-18).

Във фаза I (специфична) реакция на фиксиране на комплемента (CFR)желаният Ag (или AT) реагира с диагностичен антисерум (или Ag diagnosticum) и комплемента. Полученият Ag-AT комплекс свързва комплемента.

Във фаза II (индикатор) реакция на фиксиране на комплемента (CFR)Определете наличието на свободен комплемент чрез въвеждане в реакционната среда на хемолитичната система - овчи еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ АТ към тях. Ако Ag и AT не съответстват един на друг и не образуват имунни комплекси, тогава не настъпва фиксация на комплемента. В това. В този случай свободният комплемент взаимодейства с компонентите на хемолитичната система, фиксирайки се върху еритроцит-антиеритроцитния АТ комплекс. Последствието от това - хемолиза на индикаторни клетки (феноменът "лакова кръв") - реакцията се счита за отрицателна.

Ако е във фаза I на реакцията на свързване на комплемента (RCC) AT и Ag съответстват един на друг, тогава получените имунни комплекси се свързват с комплемента, разрушаването на еритроцитите след въвеждането на хемолитичната система не се наблюдава и реакцията се счита за положителна. Основните недостатъци на RSC: сложност (включва 5 компонента), лабилност на някои компоненти [те трябва да бъдат приготвени непосредствено преди реакцията (комплемент) или няколко дни предварително (овчи еритроцити)] и възможни анти-комплементарни свойства в серуми и Ag. Независимо от това, CSC се използва при диагностицирането на много заболявания, например при диагностицирането на сифилис (реакция на Васерман).

RSK се характеризира с висока чувствителност и специфичност и се използва за:

1) серологична диагноза инфекциозни заболявания(R. Wasserman - със сифилис, R. Borde-Zhangu - с хронична гонорея и др.);

2) идентифициране на бактерии и други микроби.

RSC се отнася до сложни серологични реакции, при които освен AG и AT има и хемолитична система (r. hemolysis), която разкрива резултата от реакцията.

RSK се извършва на два етапа с участието на две системи:

1) първата система - AG + AT + комплемент - причинява свързване на комплемента, ако AT съответства на AG. В случай на несъответствие между AT и AG, допълнението остава безплатно;

втората система (индикатор) - хемолитичен серум (хемолизини) + еритроцити - показва резултата от реакцията в първата система: в случай на положителен резултат от реакцията в първата система (образуване на AG + AT + комплементен комплекс) , хемолиза няма да настъпи във втората система поради липса на комплемент (еритроцитите се утаяват на дъното на епруветката). В случай на отрицателен резултат в първата система, втората е придружена от хемолиза, тъй като се образува комплекс от еритроцити + хемолизини + комплемент (виж Приложение 3, Фигури 7 и 8).

Реакционни компоненти:

1) тест серум (предварително инактивиран чрез нагряване при 56 0 С за 30 минути);

2) антиген (изработен от суспензии на убити микроби, микробни лизати, пълни антигени, хаптени, екстракти от тъканни липиди);

3) допълнение;

4) хемолитичен серум;

5) 3% суспензия от овчи еритроцити;

6) физиологичен разтвор;

7) контролен серум.

Допълнение. Като допълнение в RSC се използва прясна и изсушена суроватка. морско свинче, тъй като в кръвта на морско свинче се съдържа комплемент в повечетои присъства постоянно, отколкото при други животни. Преди да се зададе RSK, трябва да се извърши титруване на комплемента в реакцията на хемолиза (овчи еритроцити, хемолитичен серум, комплемент, физиологичен разтвор) и да се определи работната доза.

Титър на комплемента- най-високото разреждане на комплемента, което причинява пълен лизис на еритроцитите в присъствието на хемолитичен серум.

Работна доза комплемент- количеството на комплемента, което е с 25% по-високо от тирето.

Хемолитичен серумсе получава чрез имунизиране на зайци с 50% суспензия от овнески еритроцити. Полученият серум се инактивира чрез нагряване при 56 0 С. Определят се титърът и работната доза.

Серумен титър- максималното разреждане на серума, което причинява пълен лизис на еритроцитите в присъствието на комплемент. Като работна доза се приема хемолитичен серум в троен титър.

RSC Borde-Gangu

Реакцията се поставя за диагностициране на хронична гонорея с цел откриване на антитела срещу гонокока.

В RSC участват 2 системи: основната система е тестов серум, антиген, комплемент, а спомагателната, индикаторна или хемолитична система е хемолитичен серум и овчи еритроцити.

Ако в първата система се образува специфичен комплекс антиген + антитяло, тогава комплементът се адсорбира (комбинира се с този комплекс) и хемолиза не настъпва във втората система.

Реакцията изисква:

1. Серумът за изследване, който се получава от кръвта, взета чрез пункция на кубиталната вена на пациента. След съсирване на кръвта, серумът се аспирира в отделна епруветка и се инактивира за 30 минути при 56 0 С на водна баня.

2. Антиген - суспензия от убити гонококи.

3. Овчи еритроцити се получават от стерилна дефибринирана кръв. Те се промиват чрез центрофугиране 3 пъти с нови порции физиологичен разтвор. В реакцията се използва 3% суспензия от еритроцити.

4. Предварително се приготвя хемолитичен серум чрез имунизиране на зайци с овнешки еритроцити. Серумът се титрира преди употреба.

5. Комплемент - пресен серум от морско свинче. Кръвта се изсмуква от сърцето на морско свинче със спринцовка, след съсирване серумът се отделя. Преди експеримента работната доза на комплемента се титрира. За да направите това, вземете основното разреждане на комплемента 1:10 и го изсипете в епруветки, от 0,1 до 0,5, след което обемът във всяка епруветка се регулира с физиологичен разтвор до 1,5 ml.

В същото време се приготвя хемолитична система - хемолитичен серум, разреден в троен титър + 3% суспензия от овнечни еритроцити. И двете съставки са в различни обеми и се държат в термостат за 30 минути (сенсибилизиране на сместа), след което сместа се добавя в 1 ml към епруветките и се поставя в термостат за 30 минути. 3 епруветки служат за контрол:

1. 1 ml хемолитична система + 1,5 ml физиологичен разтвор;

2. 0,5 ml комплемент 1:10 + 0,5 ml еритроцитна суспензия + 1,5 ml физиологичен разтвор.

Титърът на комплемента е минималното количество, при което все още настъпва хемолиза. За определяне на реакцията се взема работна доза комплемент, увеличена спрямо титъра с 20-25%, т.е. обикновено количеството комплемент, което е в предпоследната епруветка с хемолиза. Увеличаването на дозата на комплемента е необходимо, тъй като в реакцията активността на комплемента може да бъде донякъде потисната от други съставки на реакцията (антиген, серум).

Изявление на основния експеримент RSC Borde - Zhangu.

В началото в 2 епруветки се излива инактивиран и разреден 1:5 тест серум. След това антигенът се излива в 1-ва епруветка, във втория физиологичен разтвор. След това към всички епруветки се добавя работна доза комплемент.

След смесване на съставките, решетката с епруветки се поставя в термостат при 37 0 С за 30 минути (горещо свързване). При студено подвързване стелажът с епруветки се поставя в ледник при температура -4 0 С за 18 часа. След задържане в термостат към всички епруветки се добавя хемолитична система. Реакцията се поставя в обем от 0,5 ml. Епруветките отново се поставят в термостат за 2 часа, след което се извършва предварителна регистрация на резултатите. Тръбите остават стайна температура, а на следващия ден се отбелязва крайният резултат.

Степента на интензивност на реакцията се оценява в плюсове. Пълно забавяне на хемолизата - четири плюса (++++), непълно - три и един плюс. Пълната хемолиза се обозначава със знаци минус (-).

RSK Васерман

Използва се за диагностициране на сифилис с цел откриване на антитела, както и за определяне на ефективността на специфичната терапия. Той се основава на принципа на реакцията за фиксиране на комплемента Borde-Gangou. Значителна разлика в реакцията на Васерман е неспецифичността на антигена: като антигени се използват липоидни екстракти от нормални животински органи.

За настройване на реакцията на Васерман е необходимо да имате серум на пациента, кръстосано реагиращи антигени № 1 и № 2, комплемент, хемолитичен серум, еритроцити на овен, физиологичен разтвор.

Диагностикум No 1 - специфичен, трепонемен.

Диагностикум № 2 е неспецифичен, кардиолипинов антиген, който представлява високо пречистен екстракт от сърце от говеждо месо с постоянен химичен състав на липиди. Липоиди, извлечени от сърцето химичен съставса близки до липоидите на treponema pallidum, следователно, въпреки че не са специфични, те фиксират антитела срещу спирохети. Тези антигени се произвеждат централно и се използват в реакцията, разредени според титъра, посочен на етикета.

Едновременно с основния експеримент се поставят 2 контроли: с очевидно отрицателни и положителни серуми.

Тестът за фиксиране на комплемента (CFR) е серологичен тест, който е сравним по чувствителност към методите за преципитация, аглутинация и неутрализация. RSK е метод, при който се използват две системи антиген-антитяло:

първият е специфичен;

вторият е индикаторен (хемолитичен).

За RSC са необходими 5 компонента: диагностичен антиген, диагностични антитела, индикаторен антиген (овчи еритроцити), индикаторни антитела (заешки хемолизини), комплемент.

Специфичното взаимодействие на антиген и антитяло е придружено от фиксация на комплемента. Полученият комплекс не се проявява визуално. Хемолитичната система се използва като индикатор. Хемолитичният серум сенсибилизира еритроцитите към действието на комплемента, в присъствието на който настъпва лизис на еритроцитите (хемолоза). Ако няма хемолиза, тогава комплементът е свързан с първата система и следователно антигенът в него съответства на антитялото - положителен отговор. Ако антитялото не съвпада с антигена, комплексът не се образува и комплементът, оставайки свободен, се комбинира с втората система, причинявайки хемолиза - реакцията е отрицателна.

За да се създаде RSC, всички реакционни съставки се приготвят и титруват преди основния експеримент.

Серумът (пациентски или диагностичен) в навечерието на реакцията се загрява на водна баня при температура 56ºС в продължение на 30 минути, за да инактивира собствения си комплемент. Някои серуми, особено от имунизирани животни, имат антикомплементни свойства, т.е. способността за свързване на комплемента в отсъствието на хомоложен антиген. Антикомплементарността се елиминира чрез третирането им с въглероден диоксид, нагряване при температура 57-58ºС, еднократно замразяване при температура от -20ºС или -70ºС и отстраняване на утайката чрез центрофугиране, добавяне на серум на комплемента в обем 1:10 серум и нагряване след инкубиране на студено за 18-20 ч. За да се предотврати антикомплементарността на серумите, те се съхраняват в лиофилизирана форма или се замразяват при ниски температури.

Като антиген за CSC могат да служат култури от различни убити микроорганизми, техни лизати, компоненти на бактерии, патологично променени и нормални органи, тъканни липиди, вируси и вирус-съдържащи материали. Много микробни антигени се произвеждат индустриално. Антикомплементарността на антигените се елиминира с помощта на методи като термолиза (многократно замразяване и размразяване), третиране с мастни разтворители (етер, хлороформ, ацетон), алкохоли (метанол, етанол) и др.

Като допълнение се използва серум от морско свинче, взет непосредствено преди експеримента; може да се използва и сух комплемент. За да се получи основен разтвор за последващо титруване, комплементът се разрежда 1:10 с изотоничен разтвор на натриев хлорид.

Овчи еритроцити се използват под формата на 3 суспензии в изотоничен разтвор на натриев хлорид. Взима се кръв (100-150 мл) от югуларна вена, поставен в стерилен буркан със стъклени перли, дефибриниран чрез разклащане за 10-15 минути и филтриран през 3-4 слоя стерилна марля за отстраняване на фибрина. Еритроцитите се промиват 3 пъти с изотоничен разтвор на натриев хлорид, като се добавя към еритроцитната утайка до първоначалния кръвен обем. Еритроцитите могат да се съхраняват 5-6 дни при 4-6ºС. Срокът на годност на еритроцитите се увеличава, когато се съхраняват с формалин.

Хемолитичен серум за CSC се получава по следния начин Зайците се имунизират чрез инжектиране в ушната вена с 50% суспензия от измити овчи еритроцити (1 ml 4-6 пъти през ден). Проба от серум се взема 7 дни след последната инжекция. Ако серумният титър не е по-нисък от 1:1200, тогава се извършва кръвопускане. Серумът се нагрява в продължение на 30 минути при температура 56ºС. За да се предотврати растежа на бактерии, към хемолитичния серум се добавя консервант (мертиолат 1:10000 или 1 борна киселина).

Хемолитичната система се състои от хемолитичен серум, смесен в равни обеми (взет в троен титър) и 3 суспензии от овневи еритроцити. За сенсибилизиране на еритроцитите с хемолизини, сместа се държи в термостат при температура 37ºС за 30 минути.

Титруване на хемолитичен серум.Серумът се титрува чрез комбиниране на 0,5 ml от него (в разреждане 1:600, 1:1200, 1:1600, 1:3200 и др.) с 0,5 ml от 3 еритроцитни суспензии и 0,5 ml пресен комплемент в разреждане 1:10 . Обемът на сместа за реакцията в контролните епруветки се довежда до 1,5 ml чрез добавяне на изотоничен разтвор на натриев хлорид. Резултатите от реакцията се вземат предвид след 1 час инкубация при температура 37ºС. Титърът на хемолитичния серум е най-високото му разреждане, което причинява пълна хемолиза. Серумът се съхранява в лиофилизирана форма.

Схема за титруване на хемолитичен серум

Титруване на комплемента.Преди експеримента основният разтвор на комплемента (1:10) се излива в серия от епруветки от 0,05 до 0,5 ml и се добавя към всеки изотоничен разтвор на натриев хлорид, като обемът на течността се довежда до 1,5 ml. Епруветките се поставят в термостат при температура 37ºC за 45 минути, след което към тях се добавя хемолитична система и се държат в термостат за 30 минути, след което се определя титърът на комплемента.

За експеримента се взема работна доза комплемент (съдържаща се в обем от 0,5 ml), която е с 20-30% по-висока от титъра.

Схема за титруване на комплемента

Термостат при 37ºС за 45 мин

Термостат при 37ºС за 30 минути

Титруване на антигена.Антигените, използвани за CSC, могат да адсорбират известно количество комплемент, т.е. имат антикомплементарни свойства. Следователно, преди експеримента, антигените се титруват в присъствието на работна доза комплемент. В по-малка степен антикомплементарните свойства се изразяват в специфични антигени, произведени при производството. Техният титър се определя не преди всеки експеримент, а веднъж месечно, като се отчита възможността за намаляването му по време на съхранение.

За да се определи титърът на антигена, той се излива в няколко епруветки в намаляващо количество от 0,5 до 0,05 ml, като обемът в тях се довежда до 1 ml чрез добавяне на разтвор на натриев хлорид. След това към всяка епруветка се добавя 0,5 ml от работната доза комплемент и се поставя в термостат за 1 час при температура 37ºС. След това към всички епруветки се добавя 1 ml от хемолитичната система, те отново се инкубират за 1 час в термостат и резултатите от реакцията се вземат предвид.

Антигенният титър се счита за най-малкото количество, при което настъпва пълна хемолиза. За CSC се използва работна доза антиген, която е приблизително 1/2-1/3 титър. Антигени, в присъствието на които титърът на комплемента намалява с повече от 30% са неподходящи за реакцията.

Схема за титруване на антиген

Термостат на 37ºС за 1 час

Термостат на 37ºС за 1 час

Извършване на основния опит на RSC.Общият обем на реакционните съставки е 2,5 ml, обемът на работната доза на всяка от тях е 0,5 ml. Серум в подходящо разреждане, антиген и комплемент се въвеждат в първата епруветка, серум в подходящо разреждане, комплемент и изотоничен разтвор на натриев хлорид (серумен контрол) във втората епруветка, антиген, комплемент и изотоничен разтвор на натриев хлорид (антигенен контрол) в третата тръба. В същото време се приготвя хемолитична система чрез смесване на 2 ml хемолитичен серум в троен титър (в сравнение с посочения в инструкциите) и 3% суспензия от овчи еритроцити (спрямо първоначалния обем на кръвта). Епруветките се държат в термостат при температура 37ºС за 1 час, след което към първите 3 епруветки (първата система) се добавя 1 ml от хемолитичната система (втора система). След старателно смесване на съставките, епруветките отново се поставят в термостат за 1 час при температура 37ºС.

Схема за провеждане на основния експеримент на RSC

Термостат на 37ºС за 1 час

Термостат на 37ºС за 1 час

Резултатите от реакцията се отчитат предварително - след изваждане на епруветките от термостата и накрая - след като са престояли 15-18 часа в хладилник или при стайна температура.

В крайното преброяване интензивността на реакцията се изразява в плюсове: (++++) - рязко положителна реакция, характеризираща се с пълно забавяне на хемолизата (течността в епруветката е безцветна, всички еритроцити се утаяват на дъното ); (+++, ++) - положителна реакция, която се проявява чрез увеличаване на цвета на течността поради хемолиза и намаляване на броя на еритроцитите в утайката; (+) - слабо положителна реакция (течността е интензивно оцветена, има малко количество еритроцити на дъното на епруветката). При отрицателна реакция (-) се наблюдава пълна хемолиза, течността в епруветката има интензивен розов цвят (лакова кръв).

Предложени са редица модификации на RSC, които се характеризират с повишена чувствителност и по-малко количество използвани съставки. Така например при вирусологични изследвания обемът на съставките за CSC в студа е 1 ml. За капково RSC вземете 1 капка серум + 1 капка антиген + 1 капка комплемент + 2 капки хемолитична система.

Реакцията на свързване на комплимента е намерила най-широко разпространение в микробиологичната и серологичната диагностика.

С помощта на RSK се откриват комплемент-фиксиращи антитела в кръвния серум на пациенти със сифилис, сап, хронична гонорея, рикетсиоза, вирусни заболявания и др.

RSC е от особен интерес за клиничната имунология. Реакцията се използва за изолиране на различни субпопулации от лимфоцити, за откриване на HLA антигени върху тромбоцити, трансплантирани лимфобласти, фибробласти, туморни клетки и тромбоцит-специфични антигени, както и съответните антитела.

INРеакцията се основава на два феномена - бактериолиза и хемолиза. В тяхното проявление участва комплементът. Следователно в RSC се използват две системи от компоненти: 1) осигурява феномена бактериолиза и се използва за диагностични цели; 2) хемолитичен, индикаторен, спомагателен; ви позволява да установите дали допълнението е свързано или не в първата система (вижте цветовата схема на фиг. I). Преди това като антиген се използва суспензия от бактерии, така че първата система се нарича бактериолитична (в положителни случаи се наблюдава бактериален лизис).

Настройката на RSC се извършва на два етапа. На първия етап се приготвя бактериолитична система: 0,5 ml от тестовия серум се смесват с антиген в епруветки, добавя се комплемент в строго определена доза (титър). Сместа от антиген - серум-комплемент (бактериолитична система) се държи на водна баня (или термостат) за 20 ... 40 минути при 37 ... 38 "C. Резултатът от взаимодействието на компонентите в епруветката е невидима, течността остава прозрачна и безцветна.За да се определи, контактува Ако комплементът е в бактериолитичната система, се провежда вторият етап на реакцията: към епруветките се добавят компонентите на хемолитичната система - измити овчи еритроцити и инактивиран хемолитичен серум, както е показано на схемата. Всички компоненти на бактериолитичната система се разклащат за смесване в епруветката, поставена на водна баня при 37...38 "С за 20...40 минути. След това се добавят компонентите на гемологичната система, всичко се разклаща втори път и отново се поставя на водна баня за 10-15 минути.

Предварителен резултат. Ако серумът е получен от болно животно, тогава той съдържа антитела, които се комбинират със специфичен антиген. Комплементът се свързва с този комплекс (антиген - антитяло) - хемолиза не настъпва, резултатът е положителен.

В серума от здраво животно няма антитела: комплексът антиген-антитяло не се образува, комплементът в бактериологичната система не се свързва. Когато се добавят еритроцити и хемолизин (това е антиген и антитяло помежду си), комплементът реагира с този комплекс - ще настъпи хемолиза, резултатът е отрицателен (виж цвят Фиг. II).

Окончателен отчет на резултата. Епруветките се оставят на стайна температура за 15...20 ч. Ако серумът в бактериолитичната система е от болно животно, в епруветката се образува специфичен комплекс антиген-антитяло, който адсорбира (свързва) целия добавен комплемент. Следователно във втората, хемолитична, хемолизна система няма да се случи, еритроцитите ще се утаят на дъното на епруветката, супернатантата е прозрачна. Резултатът от RSC е положителен.

Ако няма специфични антитела към антигена, използван в тестовия серум (в случаите, когато серумът е от здраво животно), комплексът антиген-антитяло не се образува в бактериолитичната система и следователно комплементът в тази система не е адсорбиран, но остава свободен. Когато се добавят компонентите на хемолитичната система (във втората фаза на реакцията), комплементът взаимодейства с втория комплекс (хемолизин-еритроцити), настъпва хемолиза на еритроцитите - не се образува утайка, течността в епруветката е лаково червена . Резултатът от RSK е отрицателен.

RSK. използване: 1) за откриване на специфични антитела в серума на болно животно (при диагностициране на бруцелоза, перипневмония, сап, лептоспироза, трипанозомоза и др.); 2) за откриване на специфичен антиген (бактериален или вирусен) в тестовия материал в присъствието на специфичен имунен серум.

За да настроите RSK, трябва да имате: получени серумни проби за изследване; два серума, за които е известно, че са положителни (стандартни, осигуряващи положителен резултат) и два нормални серума. Всички серуми в разреждане 1:10 се инактивират при 56...58 °C за 30 минути; антиген в разреждане според титъра; комплемент, разреден в съответствие с установения титър по време на титруване в бактериолитична система; хемолизин в работен титър; овен еритроцити (I: 40); физиологичен разтвор, градуирани пипети, епруветки, стелажи, водна баня при 37...38 °C.

Преди поставяне на RSC, овчата кръв се дефибринира, еритроцитите се промиват с физиологичен разтвор чрез центрофугиране до пълна прозрачност на супернатантата, която се отстранява чрез изсмукване, а утаените еритроцити се разреждат във физиологичен разтвор 1:40 (2,5%). Антигенът се разрежда според титъра, посочен на етикета от биофабриката. Хемолизинът и комплементът се титруват преди задаване на RSK.

Антигенът за CSC се приготвя в биофабрики. Обикновено това са екстракти от унищожени микробни суспензии (или тъкани, съдържащи вирус). Антигените не трябва да имат хемолитичен ефект, който се контролира по време на реакцията (1 ... 2 дози антиген и 0,5 ml еритроцитна суспензия се изсипват в епруветка: не трябва да има хемолиза). На ампулата с антигена биофабриката показва, че е предназначена за RSK (сапни, бруцелоза или други). Кутията на опаковката показва партидния номер, датата на производство, срока на годност, активността на антигена, тоест в какво разреждане трябва да се използва при настройване на RSK (1:100, 1:150 и т.н.). При някои заболявания други материали служат като антигени; например, за диагностициране на перипневмония при говеда, антигенът за CSC е лимфата на теле, експериментално инфектирано подкожно или интраплеврално. При продължително съхранение на антигени техният титър отново се проверява в лаборатория по специална схема за титруване.

Тестовите серуми, получени за изследването, се разреждат с физиологичен разтвор 1: 5 или 1: 10, инактивират се чрез нагряване на водна баня за унищожаване на собствения им комплемент за 30 минути при 56 ... 58 "C (серуми на магарета, мулета, кошки - при 61°C).

Хемолизин се приготвя в биофабрики чрез хиперимунизиране на зайци с измити овнешки еритроцити. За да направите това, зайците се инжектират интравенозно 4...5 пъти на интервали от 2...3 дни с 40...50% суспензия от еритроцити. Седмица след последната инжекция се взема кръв от зайци, серумът е стерилно аспириран, инактивиран, консервиран с глицерол 1: 1 или 0,5% фенол, титрува се, налива се в ампули. В лабораториите, преди задаване на RSK, те се титруват отново.

Схема за титруване на хемолизин.Пригответе: i) Разреждане на комплемента 1:20; 2) хемолизин 1:100 (0,2 ml хемолизин + 9,8 ml физиологичен разтвор); 3) суспензия от овчи еритроцити 1:40; 4) физиологичен разтвор на NaCl.

За да се настрои реакцията на титруване, два реда епруветки се поставят в стелаж - единият спомагателен само за приготвяне на разреждания на хемолизин, вторият - за самото титруване. Първоначалното разреждане на хемолизин 1:100 се добавя към първата епруветка от всеки ред и след това се прави серийно разреждане. Всички епруветки се разклащат и се поставят на водна баня при 37...38°C за 10...15 минути. Отчитане на резултата: в този пример най-малкото количество (или най-голямото му разреждане), което е довело до пълна хемолиза, е 1: 2000, т.е. това е неговият действителен титър. Работният титър е 2 пъти по-концентриран - 1:1000.

0,5 ml (означени със стрелки) от всяко разреждане от епруветките от първия ред се прехвърлят в отделни епруветки от втория ред. 0,5 ml комплемент (1:20), 0,5 ml овен еритроцити (2,5% суспензия или 1:40) и 1 ml физиологичен разтвор се добавят към всички епруветки от втория ред, така че обемът на течността във всеки флакон беше 2,5 мл.

Забележка. Въз основа на факта, че 5 компонента от по 0,5 ml всеки ще участват в окончателната формулировка на RSC, което ще съставлява обем от 2,5 ml, този обем се наблюдава по време на цялата работа.

Епруветките се разклащат и се поставят на водна баня за 10-15 минути. Хемолизата ще се случи предимно в епруветки с високо съдържание на хемолизин (най-малкото му разреждане е 1: 500, 1: 1000 ...). Най-малкото количество хемолизин (най-високото му разреждане), което е причинило пълна хемолиза на еритроцитите при тези условия, се нарича ограничаващ (действителен) титърхемолизин. За по-нататъшна работа хемолизинът се използва 2 пъти по-концентриран, тоест в двойно количество, двоен титър, който се нарича работно заглавие.Например, ако действителният титър е I:2500 (или 1:2000), тогава работният титър съответства на разреждане 1:1250 (или 1:W00).

Комплементът е неразделна част от пресния серум, лимфа, тъканни течности различни видовеживотни (и хора); открит от Бюхнер (1889). При насекомите комплементът отсъства. Комплементът е вещество с протеинова природа, със сложна структура, бързо инактивирано при нагряване, продължително съхранение, излагане на ултравиолетово лъчение, силно разклащане, филтриране през керамични филтри, добавяне на каолин, киселини, основи, алкохол, ацетон, хлороформ, дестилиран вода, суспензия от бактерии и др. Комплементът може да се запази чрез добавяне на 5 g натриев сулфат, 4 g борна киселина на 100 ml серум от морско свинче. Активността на комплемента се поддържа до шест месеца. По най-добрия начинконсервиране - сушене под вакуум при ниска температура (лиофилизация). В запечатани ампули в това състояние се съхранява две години. Преди всяко производство на RSK активността на комплемента се проверява чрез титруване, тоест се определя неговият титър - оптималното количество, необходимо за тази реакция. Комплементът се титрира два пъти: в хемолитична и бактериолитична система.

За титруване на комплемента в хемолитичната системаприготвят се компоненти: комплемент при разреждане 1: 20 (1 ml комплемент + 19 ml физиологичен разтвор); хемолизин, разреден според работния титър; суспензия от измити овчи еритроцити (1:40), физиологичен разтвор. Епруветките се поставят в статив и в тях се изсипват различни количества комплемент с градуирана пипета с интервал от 0,03 ml (0,13; 0,16; 0,19; 0,22 ..: до 0,43 ml). След това добавете останалите компоненти (фиг. 57). Всички епруветки се разклащат и се поставят на водна баня при 37...38 "С за 10...15 минути и резултатът се записва.

Отчитане на резултата: най-малкото количество комплемент, което е осигурило пълна хемолиза (в този пример, 0,25 ml) се приема като титър на комплемента.

Резултатът от титруването се взема предвид в епруветките с най-високо съдържание на комплемент, където преди всичко се очаква хемолиза. Най-малкото количество комплемент, което осигурява пълна хемолиза на еритроцитите при тези условия се нарича титър на комплемента в хемолитичната система.

За титруване на комплемента в бактериолитичната системанеобходимо е да има всички компоненти на реакцията: комплемент (1:20), еритроцити (1:40), хемолизин в работен титър, два положителни и два нормални серума, специфичен антиген. Серумите се разреждат с физиологичен разтвор 1:10, инактивират се за 30 минути при 56 ... 58 X. Всеки серум се излива в два реда епруветки от 0,5 ml. Комплементът се добавя в увеличаващи се количества към епруветките от всеки ред, както при титруване в хемолитична система; започва се с количеството, взето като титър в хемолитичната система, след което във всяка следваща епруветка дозата се увеличава с 0,03 ml, като обемът се изравнява до 0,5 ml с физиологичен разтвор.

След това към един ред епруветки с положителни и нормални серуми се добавят 0,5 ml антиген и към втория ред на всеки серум се добавят 0,5 ml физиологичен разтвор. Всички епруветки се разклащат и се поставят на водна баня за 30-40 минути. След това към всички епруветки се добавят 0,5 ml хемолизин и 0,5 ml еритроцити, разклащат се и се поставят на водна баня за 10-15 минути. Най-малкото количество комплемент, което осигурява пълен лизис на еритроцити в двата реда епруветки (с антиген и без антиген) на два нормални серума, в един ред (без антиген) на всеки положителен серум и с пълно забавяне (отсъствие) на хемолиза в редовете положителни серуми с антиген (в тези същите дози комплемент), се наричат титър на комплемента,който се използва при формулирането на основния опит на RSC в диагностичните изследвания.

Основният опит на RSC (действителното диагностично изследване). Два реда епруветки се поставят в стелажи според броя на изследваните серумни проби. 0,5 ml от всеки инактивиран серум се изсипват в две епруветки: към едната се добавя антиген - 0,5 ml, към другата се добавя 0,5 ml физиологичен разтвор (без антиген) и чрез добавяне на комплемент те изграждат бактернолитичната система и след това добавете хемолитик.

Необходими компоненти: 1) тест серум, инактивиран, разреден с физиологичен разтвор 1:10; 2) специфичен антиген, разреден според титъра, посочен от биофабриката на етикета на опаковката; 3) комплемент в установения титър; 4) хемолизин в работен титър; 5) суспензия от измити овчи еритроцити 1:40; 6) физиологичен разтвор на NaCl. Тестовите серуми се изсипват в два реда епруветки. За произволен брой тествани серуми, известни положителни серуми (които дава положителен резултат) и нормални (от здраво животно, което дава отрицателен резултат) се използват като контроли.

Епруветките с компонентите на бактериолитичната система се разклащат, поставят се на водна баня за 20...40 min при 37...38°C. Епруветките на бактериолитичната система от втория ред без антиген се разклащат, поставят се на водна баня при същите условия.

След това компонентите на хемолитичната система се добавят към всички епруветки от първия и втория ред и се поставят на водна баня за втори път за 10..15 минути. Във всички епруветки от втория ред без антиген настъпва пълна хемолиза.

До получаването на крайния резултат, епруветките се оставят на стайна температура за 18 ... .

Показанията за реакцията в епруветки с тест серуми се считат за надеждни, ако няма хемолиза в епруветки с положителни серуми и антиген, с пълна хемолиза в епруветки с положителен серум без антиген и във всички епруветки с известен нормален серум (фиг. 61).

Тази реакция трябва да бъде придружена от контроли на антиген, комплемент, хемолизин, еритроцити. За да направите това, антигенът с овчи еритроцити се излива в отделни епруветки; комплемент с еритроцити без хемолизин; хемолизин с еритроцити без комплемент; еритроцити и физиологичен разтвор. Обемът във всяка епруветка се регулира с физиологичен разтвор до 2,5 ml. Епруветките се разклащат и се поставят на водна баня при 37°С за 20 минути. Всички контролни епруветки трябва да са без хемолиза.

RSC резултатобикновено се изразява в кръстове. Индикатори за положителен резултат от реакцията: + + + + (///) - пълно утаяване на еритроцитите (без хемолиза), течността над утайката е безцветна, + + + (///) - течността над утайката е едва забележимо оцветена в жълтеникаво. Съмнителен резултат от реакцията: наличието на еритроцити, утаени на дъното и частично оцветяване на супернатантната течност поради лизис на част от еритроцитите, се обозначава с + + - (++), тоест две и две и a половин кръстове. Изразена хемолиза (без утайка) или с малка утайка (+) е отрицателен резултат.

Дългосрочна реакция на свързване на комплемента (RDSC).По-ефективен по отношение на чувствителността, за разлика от обичайния класически RSC. Същността на реакцията е, че бактериолитичната система се поддържа на три различни температурни условия: след смесване на компонентите при стайна температура в продължение на 15 минути, след това при ниска температура (4 ° C) в хладилник за 18 ... 20 часа и на водна баня за 15 минути. След това се добавя хемолитичната система, разклаща се, отново се поставя във водна баня и реакцията се записва, както в RSC. Потвърдена е ефективността на RDSC при диагностицирането на редица инфекциозни заболявания (туберкулоза, вибриоза, бруцелоза и др.).

Реакция на потискане на свързването на комплемента (RPSK) или реакция на инхибиране, индиректен RSK.Друг компонент участва в тази реакция - стандартен имунен серум, съдържащ антитела срещу антиген, който обикновено се използва за диагностика и следователно реагира положително при класическия CSC.

Тестовият серум се смесва с антигена и се държи известно време без комплемент. След това се добавят комплемент и стандартен серум, епруветките се разклащат и се поставят на водна баня за 20...30 минути, след което се добавя хемолитичната система и се поставя отново във водната баня. Ако няма хемолиза, резултатът е отрицателен, тъй като тестовият серум не реагира с антигена, а последният реагира с стандартен серумчрез свързване на комплемента. Ако тестовият серум е от болно животно, той съдържа специфични антитела по отношение на антигена, т.е. възниква реакция между антигена и антителата без свързване на комплемента. Антигенът, взаимодействащ с антителата на тестовия серум, не реагира (се потиска) със стандартния (очевидно известен специфичен) серум, комплементът остава свободен и реагира в хемолитичната система - настъпва хемолиза, резултатът от реакцията е положителен по отношение на тестовия серум.

Метод флуоресцентни антитела (MFA).Възможностите на този метод се дължат на специфичността на първата фаза на серологични реакции с висока чувствителност на луминесцентен анализ. За прилагането на MFA е необходимо наличието на високоспецифични имунни луминесцентни серуми. Известно е, че в различни серологични тестове, използвани в микробиологичната практика, участват основно три компонента: бактериален антиген, антитяло и комплемент. И трите компонента всъщност са антигени и имунни серуми и съответно срещу всеки от тях могат да се получат луминесцентни антитела. В зависимост от това какъв тип луминесцентен серум се използва (срещу бактериален антиген, антибактериални антитела, комплемент), се разграничават три основни варианта на метода на флуоресцентните антитела: директен (1) и индиректен (2) варианти и модификация на индиректния вариант с помощта на комплемент. Имунологичната реакция между антиген и антитяло се извършва в тези модификации директно върху предметното стъкло. За фиксиране на микроорганизми се използват органични разтворители: ацетон, етанол, метанол, диоксан, както и конвенционални фиксатори, използвани в микробиологичната практика: формалин, смес на Никифоров, течност на Карной и др.

Директен вариант. Върху готовия препарат се нанася специфичен луминесцентен серум за определено време, след което излишният серум се отцежда, препаратът се измива и се разглежда под флуоресцентен микроскоп. Този метод се използва за откриване на бактерии в патологичен материал, обекти на околната среда, както и за идентифициране на патогени в култури.

Индиректен (двустепенен) вариант. На първия етап възниква специфично свързване на антигена със съответното антитяло от небелязан серум. На втория етап специфично немаркирано антитяло се свързва с антивидово луминесцентно антитяло, съдържащо се в серума на животно, имунизирано с глобулини (или пълнокръвен серум) на животинския вид, от който е използван имунният серум.

Непряк антикомплементарен (тристепенен) вариант. Първият етап: образуването на антиген-небелязан антитяло комплекс. Втора стъпка: наслояване на нормален серум, съдържащ комплемент. Трети етап: комплексът антиген-антитяло-комплемент се третира с луминесцентен антикомплементарен серум, приготвен по време на имунизацията на зайци със серума на животинския вид, който е служил като източник на комплемента.

Индиректните варианти на MFA могат да се използват както за откриване на антиген, така и за откриване на антитела. Освен това, за да настроите двуетапен вариант, трябва да имате ограничен набор от антивидови луминесцентни серуми (срещу глобулини на бик, овца, кон, прасе и др.), а за антикомплементарен вариант, достатъчно е да имате само един луминесцентен серум срещу глобулини на морско свинче.

Техника и имунолуминесценция и микроскопия. В практиката на ветеринарните бактериологични лаборатории се използват луминесцентни серуми от биофабрика. В зависимост от вида на флуорохрома, луминесцентните серуми осигуряват или зелено сияние на обекта (багрило на флуоресцентна основа), или червено (багрило на базата на родамин).

За провеждане на имунолуминесцентна микроскопия, тестовият материал трябва да се нанесе върху обезмаслено, тънко предметно стъкло без надраскване. При изследване на органи и тъкани на животните се приготвят препарати-отпечатъци на тънък слой. Препаратите се сушат на въздух и се поставят във фиксираща течност (етанол - 15 минути, метанол - 5 минути, ацетон - 5 минути). При необходимост, след фиксиране, препаратите могат да се съхраняват известно време в хладилник. Последователността и по-нататъшните процедури зависят от вида на използвания MFA (едноетапна, двуетапна, триетапна). Обработката на препарати с луминесцентни серуми, както и немаркирани серуми от първи етап и комплемент, се извършва при 37 X във влажна камера (петри блюда с навлажнена филтърна хартия).

Едноетапна опция.Луминесцентен серум се нанася върху предметно стъкло с фиксиран тестов материал (в разреждането, посочено на ампулата). Лекарството се поставя във влажна камера за 15...20 минути при 37 "С. След това се промива с буфериран физиологичен разтвор (рН 7,4) в съд, като разтворът се сменя след 5...10 минути няколко пъти, или под течаща чешмяна вода в продължение на 3...5 минути Водата трябва да е неутрална и без желязо. След това препаратът (може да има няколко намазки върху едно стъкло) се изсушава на въздух или филтърна хартия, след което капка капка буфериран глицерол с Прилага се pH от 8,0 и се покрива с покривно стъкло. Потопяема нефлуоресцентна течност се нанася върху покривното стъкло и се микроскопира.

Вариант на два етапа.Капка имунен немаркиран серум от първия етап се нанася върху предметно стъкло с тестовия материал. Лекарството се поставя в термостат във влажна камера за 15...20 минути. След това се измива, както е описано по-горе, изсушава се и се нанася капка луминесцентен антивидов серум. Лекарството отново се поставя в термостат във влажна камера за 15-20 минути. Повторете процедурата за измиване и изсушете с филтърна хартия. Прилага се буфериран глицерол, покрива се с покривно стъкло, нанася се нефлуоресцентна имерсионна течност и се микроскопира.

Тристепенен вариант (антикомплементарен).Капка имунен немаркиран серум от първия етап се нанася върху предметно стъкло с тестовия материал. Лекарството се поставя в термостат, както е описано по-горе, изсушава се и върху намазката се нанася капка комплемент. Лекарството отново се поставя във влажна камера и в термостат за 15...20 минути, след което се измива и се нанася луминесцентен антикомплементарен серум. Следващите процедури са подобни на едноетапния вариант.

Подготовка и обработка на контролни препарати. 1. При директния вариант, за да се определи специфичността на реакцията между антигена с луминесцентен серум, препарати за намазка от хетероложни микробни видове трябва да се третират със същия серум. Тези видове трябва да бъдат антигенно сходни, но да се различават по морфология от изследваните микроорганизми; отдалечени по антигенно отношение към изследваните микроорганизми, но сходни по морфология и разпространение с тях. Препаратите за отпечатък се третират с луминесцентен нормален серум.

2. За индиректния вариант е необходимо да има три контролни препарата, третирани с нормален серум, луминесцентен антивидов серум без имунен немаркиран серум и луминесцентен антивидов серум с известен имунен серум от първи етап.

3. За индиректен вариант с допълнениенеобходими са контролни препарати, при обработката на които имунният серум се заменя с нормален серум от същия вид и в същите разреждания, както и препарати, третирани с всички съставки с изключение на имунния серум.

Оценка на резултатите. Отчитат се яркостта, цвета, локализацията и структурата на сиянието. Бактериите, оцветени с луминесцентен серум, белязан с флуоресцеин изотиоцианат, имат ярко зелено сияние около периферията под формата на ръб или ореол, централната част свети слабо. Такова сияние се нарича специфично, за разлика от неспецифичното, когато цялото клетъчно тяло свети равномерно. Колкото по-изпъкнала е бактериалната клетка в препарата, толкова по-остър е ръбът. Това сияние може да се обясни с факта, че няколко пъти повече антитела се проектират върху ретината на наблюдателя от единица площ на "периферията" на клетката, отколкото от централната част на микробната клетка. Трябва да се има предвид, че пластмасовите клетки (лептоспири, вибриони) нямат контур или той е едва забележим. При клетки, потопени в тъканна течност и в млади антраксни бацили, контурът обикновено не е рязко изразен.

Интензитетът на луминесценция се оценява по четирикръстовата система: + + + + - много ярка флуоресценция по периферията на микробната клетка, ясно контрастираща с тъмното тяло на клетката; + + + - ярка флуоресценция на периферията на клетката; + + - слабо сияние на периферията на клетката; + - няма контрастно сияние на периферията на тялото на микробната клетка. Липсата на специфично сияние се обозначава с „-“ (видими са сенките на микроорганизмите). При диагностициране на различни патогени положителен резултат най-често се счита за специфичен блясък на бактериални клетки не по-нисък от четири или три кръста.

61. Реакции на комплемента. Реакция на свързване на комплемента. Механизъм, компоненти, методи на настройка, приложение. Реакция на радиална хемолиза

Реакции, включващи комплемент

Реакции, включващи комплементна базата на активирането на комплемента от комплекс антиген-антитяло (реакция на фиксиране на комплемента, радиална хемолиза и др.).

Реакция на фиксиране на комплемента (RSK) се крие във факта, че когато си съответстват, антигените и антителата образуват имунен комплекс, към който чрез Fc -фрагмент от антитела се присъединява към комплемента (С), т.е. свързването на комплемента се осъществява с комплекс антиген-антитяло. Ако комплексът антиген-антитяло не се образува, тогава комплементът остава свободен (фиг. 13.8). RSK се провежда в две фази: 1-ва фаза - инкубиране на смес, съдържаща три компонента антиген + антитяло + комплемент; 2-ра фаза (индикатор) - откриване на свободен комплемент в сместа чрез добавяне към нея на хемолитична система, състояща се от овнечни еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ антитела към тях. В 1-ва фаза на реакцията, по време на образуването на комплекса антиген-антитяло, настъпва свързване на комплемента, а след това във 2-ра фаза няма да настъпи хемолиза на еритроцити, чувствителни от антитела; реакцията е положителна. Ако антигенът и антитялото не съответстват един на друг (няма антиген или антитяло в тестовата проба), комплементът остава свободен и във 2-ра фаза ще се присъедини към комплекса еритроцит-антиеритроцитно антитяло, причинявайки хемолиза; реакцията е отрицателна.

RSK се използва за диагностициране на много инфекциозни заболявания, по-специално сифилис (реакция на Васерман).

Тази реакция се използва за откриване на антитела в кръвния серум на пациенти с бактериални, вирусни, протозойни инфекции, както и за идентифициране и тип вируси, изолирани от пациенти. RSK се отнася до сложни серологични реакции, в които освен антиген, антитяло и комплемент участва и хемолитичната система, която разкрива резултатите от реакцията. CSC протича в две фази: първата е взаимодействието на антигена с антитялото с участието на комплемента, а втората е идентифициране на степента на свързване на комплемента с помощта на хемолитичната система. Тази система се състои от овнешки еритроцити и хемолитичен серум, получени чрез имунизация на лабораторни животни с еритроцити. Еритроцитите се третират - сенсибилизират се чрез добавяне на серум към тях при температура 37°C за 30 минути. Лизис на сенсибилизирани овнечни еритроцити се случва само в случай на прикрепване към хемолитичната система на комплемента. При негово отсъствие еритроцитите не се променят. Резултатите от RSK зависят от наличието на антитела в тестовия серум. Ако серумът съдържа антитела, хомоложни на антигена, използван в реакцията, тогава полученият комплекс антиген-антитяло се свързва, свързва комплемента. Когато се добави хемолитична система, в този случай няма да настъпи хемолиза, тъй като целият комплемент се изразходва за специфичната връзка на комплекса антиген-антитяло. Еритроцитите остават непроменени, така че липсата на хемолиза в епруветката се записва като положителен RSK. При липса на антитела, съответстващи на антигена в серума, специфичният комплекс антиген-антитяло не се образува и комплементът остава свободен. Когато се добави хемолитична система, комплементът се прикрепя към нея и предизвиква еритроцитна хемодиаза. Разрушаването на еритроцитите, тяхната хемолиза характеризира отрицателна реакция.

За производството на RSK са необходими серум на пациента, комплемент, хемолитична система, състояща се от овчи еритроцити и хемолитичен серум, както и изотоничен разтвор на натриев хлорид. Реакцията се поставя в серологични епруветки. Овчи еритроцити се получават от дефибринирана овча кръв, като се промиват три пъти с изотоничен разтвор на натриев хлорид. Хемолитичният серум се произвежда готов в ампули, на етикета на които е посочен неговият титър, тоест максималното разреждане на серума, който все още причинява хемолиза, когато се добавя към еритроцитите в присъствието на комплемент. Хемолитичният серум се получава чрез имунизиране на животни, като зайци, с овнешки еритроцити. При настройване на реакцията се използва серум в троен титър. Например, титърът на хемолитичния серум е 1: 1200, а работното разреждане е 1: 400. Като допълнение се използва пресен кръвен серум от морско свинче (в рамките на 24-48 часа) или сух комплемент в ампули. Преди да се установи RSK, комплементът се разрежда 1:10 и се титрува, за да се установи титъра - най-малкото количество комплемент, което дава хемолиза на еритроцитите, когато се комбинира с хемолитична система, използвана в тази реакция. Като се имат предвид възможните антикомплементарни свойства на антигена, при настройване на реакцията се прави отстъпка от 20-30% към установения работен титър на комплемента.
Антигенът за CSCs са суспензии от убити бактерии, екстракти, приготвени от тези суспензии, отделни химични фракции на микроби. Основното изискване за антигена е липсата на инхибиране на активността на комплемента. Не трябва да има антикомплементарни свойства. За да се разкрият тези свойства на антигена, комплементът се титрира допълнително в присъствието на антигена, използван в реакцията. Има определени схеми за настройка на RSC. Резултатите от реакцията се вземат предвид от наличието или отсъствието на хемолиза на еритроцитите в хемолитичната система. RSK се използва при диагностициране на сифилис (реакция на Васерман), гонорея (реакция на Борде-Гангу), токсоплазмоза, рикетсиозни и вирусни заболявания.

Реакцията на радиална хемолиза (RRH ) поставени в ямки от агар гел, съдържащ овнечни еритроцити и комплемент. След добавяне на хемолитичен серум (антитела срещу овнени еритроцити) към ямките на гела, около тях се образува хемолизна зона (в резултат на радиална дифузия на антитела). По този начин е възможно да се определи активността на комплемента и хемолитичния серум, както и антителата в кръвния серум на пациенти с грип, рубеола, енцефалит, пренасян от кърлежи. За да направите това, съответните антигени на вируса се адсорбират върху еритроцитите и кръвният серум на пациента се добавя към гнездата на гела, съдържащ тези еритроцити. Антивирусните антитела взаимодействат с вирусни антигени, адсорбирани върху еритроцитите, след което компоненти на комплемента се прикрепват към този комплекс, причинявайки хемолиза.